リソソーム内のpHは弱酸性であり、酸性で活性化する様々な加水分解酵素によって生体成分を分解する。また、リソソーム病においては、リソソーム内pHの異常が疾病に繋がっているとの報告もある（JBC, 284, 7681-7686 (2009)など）。そのため、リソソーム内のpHを測定することは、疾病メカニズムの解明に繋がると期待される。本研究では、生きた細胞内で、リアルタイムにリソソーム内pHを定量可能な新たな蛍光プローブの開発を目的とした。
申請者らによってこれまでに開発されているレシオ型pH蛍光プローブ：SiRpH類（J. Am. Chem. Soc., 140, 5925-5933 (2018)）の励起波長を、蛍光顕微鏡のレーザー波長に適合させるためには20-30 nmの短波長化が必要であった。そこで、蛍光団母核をC-rhodamine(CR)類に代えたCRpH2を分子設計・合成し、その光学特性を調べた。その結果、吸収波長の短波長化に成功し、汎用されているレーザー波長の561 nmと633 nmに最適であった。また、蛍光色素母核を変えることで、蛍光量子収率も大きく上昇させることに成功した。異なる2波長で励起した際の蛍光強度のレシオ値変化の値は、pKa = 5.5と算出され、リソソーム内pHの測定に適していた。次に、開発したCRpH2を酸性オルガネラであるリソソームへと送達するため、エンドサイトーシスによりリソソームへと送達されることが知られている高分子であるデキストラン(Dex)にCRpH2を標識し、CRpH2-Dexを作成した。そして、リソソームのマーカータンパク質であるTmem192(EGFP融合)を安定発現させたMEF細胞にCRpH2-Dexを導入し、生細胞イメージングを行った。その結果、マーカータンパク質とプローブの蛍光が高い重なりを示した蛍光画像が観察され、リソソーム内の平均pHは5.1となり、これまでの報告と矛盾のない値であった。このように、汎用性の高いリソソーム内pHの測定に適した蛍光プローブの開発に成功した。
The pH in lysosomes is weakly acidic, and the lysosomes contain various hydrolases, which can be activated in acidic conditions and metabolize biomolecules. Further, it is reported that, in the lysosomal diseases, the lysosomal pH is unordinary and this may be deeply related to these diseases (JBC, 284, 7681-7686 (2009), etc.). Therefore, to measure the lysosomal pH is expected to lead to the elucidation of the mechanism of these diseases. In this study, we aimed to develop novel fluorescent probes for quantifying the lysosomal pH in living cells in real time.
So far, the applicants have developed ratiometric fluorescent probes for pH: SiRpHs (J. Am. Chem. Soc., 140, 5925-5933 (2018)), and their excitation wavelengths need to be 20-30 nm shortened to be fit for the widely used laser wavelengths of the confocal fluorescence microscopy. So, we designed and synthesized CRpH2 by changing the dye scaffold of the pH probes to C-rhodamine (CR) and examined their photophysical properties. As a result, we succeeded in shortening the absorption wavelength of the pH probes, and their wavelength was suitable for the widely used lasers, i.e., 561 nm and 633 nm. Moreover, we also succeeded in a large increment of the fluorescence quantum yield of the pH probes by changing the dye scaffold of the pH probes. The fluorescence intensity ratio by using 2 different excitation wavelengths was calculated to show pKa = 5.5, and this pKa value was suitable for the measurement of the lysosomal pH. Then, to deliver the developed pH probe, CRpH2, to the acidic organelle lysosomes, we labelled CRpH2 to a macromolecule dextran (Dex), which is well-known to be delivered to lysosomes by endocytosis, and prepared CRpH2-Dex. Then, we applied CRpH2-Dex to EGFP-fused Tmem192 (lysosomal maker protein)-stably expressing MEF cells, and performed the live-cell fluorescence imaging. As a result, the well-merged fluorescence image between the marker proteins and the pH probes was observed, and the average lysosomal pH value was calculated to be 5.1, which is consistent to that of the previous reports. Thus, we successfully developed a widely useable pH fluorescent probe optimal for the measurement of the lysosomal pH.
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