LINE-1はヒトゲノムの約17%を占め、ゲノム上に自分自身のコピーを増やしていく性質を持つレトロトランスポゾンである。初期胚発生過程においてLINE-1は高発現するが、その生物的な意義や、宿主への影響についての研究はまだ少ない。本研究では、LINE-1がコードするタンパク質L1ORF1pに対するモノクローナル抗体を作製した。2細胞期胚様ES細胞抽出液を用いて免疫沈降法により精製し、質量分析を行ったところL1ORF1pの相互作用因子としてTDP-43を同定した。初期胚発生においてTDP-43とLINE-1の挙動を探索するため、TDP-43の変異体を作製し、免疫沈降方法およびLINE-1転移活性測定系により、TDP-43のN末ドメインがL1ORF1pと直接相互作用し、C末ドメインがLINE-1の転移抑制に重要であることを見出した。また、TDP-43のN末欠損変異体を発現するマウスES細胞株において、LINE-1のコピー数が20%程度増加していることを見出した。また、L1ORF1pの発現上昇が認められた。以上の結果から、TDP-43はL1ORF1pとの相互作用を介してLINE-1の転移反応を抑制していることが明らかとなった。次にマウス初期胚発生において高発現するLINE-1の転移反応への影響を見るため、TDP-43に対するsiRNAをマウス受精卵に注入し、TDP-43の発現抑制実験を行なった。その結果、胚盤胞のサイズが小さくなったことから細胞増殖速度の低下が示唆されたものの、多能性マーカー遺伝子の発現量に目立った変動がないことから、TDP-43の発現抑制は受精卵の発育プログラムに対して影響を与えないことが示唆された。一方でTIP-seq法(Transposon insertion profiling by sequencing)を用いて、TDP-43発現抑制胚におけるLINE-1の新規挿入箇所の解析を行ったところ、LINE-1の新規挿入が数百箇所検出された。以上の結果からTDP-43は初期胚発生の過程で脱抑制されるLINE-1の転移活性を抑制し、ゲノム恒常性の維持に寄与していていることが明らかとなった。
Class I Long interspersed nuclear element (LINE-1 or L1) has occupied ~17% of the human genome as a non-LTR retrotransposon through expanding itself with a "copy and paste" fashion. Intact LINE-1 has two open reading frames (ORFs) that encode respect L1ORF1p and L1ORF2p proteins, which assemble with LINE-1 mRNA to form ribonucleoprotein (RNP) particles that are capable of retrotransposition. It is reported that LINE-1 is highly expressed during mammalian preimplantation embryogenesis (Grow, E.J. Nature Genetics, 2017). Bearing violent LINE-1 expression, the embryonic genome must have a mechanism repressing LINE-1 retrotransposition to protect its integrity, which remains poorly understood. Using two-cell-like (2C-like) mouse embryonic stem cells (mESCs), we identified that TDP-43 is a robust repressor to LINE-1 retrotransposition. Loss-of-function analysis of TDP-43 function domains suggested that the N-terminal and C-terminal disorder regions are essential for inhibiting LINE-1 retrotransposition. Moreover, we established mouse ES cell lines expressing TDP-43 lacking N-terminal domain. To examine LINE-1 copy number in the cell line, we performed quantitative PCR using primer sets targeting active LINE-1 subfamilies. Indeed, the copy number of active LINE-1 subfamilies were increased by around 20%. We next moved on to analyzing the further impact of TDP-43 knockdown (KD) in embryogenesis. TDP-43 KD in mouse embryos by injecting siRNA has little effect on preimplantation development. To quantitate the activity of LINE-1 retrotransposition, we carried out Transposon Insertion Profiling-sequencing (Tip-seq). After normalizing read counts, we found genomic LINE-1 copies were increased upon TDP-43 KD. Taken altogether, our results suggested that TDP-43 represses LINE-1 retrotransposition post-transcriptionally and keep host genome integrity during preimplantation embryogenesis.
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