今年度は、昨年度にClostridium属細菌から発見した、天然物からは単離例のない(S)-3-hydroxy-3-(2-oxopropyl) indolin-2-oneについて、免疫機能阻害機構の解析を試みた。本化合物はこれまで、LPS刺激により生産される炎症メディエーター・一酸化窒素 (NO) の産生を抑制することを明らかとしていた。そこで、NO産生合成酵素 (iNOS) の発現量に与える影響をRT-PCRやWestern Blottingにより解析した。しかし、iNOSの発現には顕著な変化は見られなかったことから、本化合物にはiNOSの酵素阻害活性もしくはNO除去活性を有することが予想された。まず、本化合物とNOが試験管内で反応するのかLC/MSにより解析したところ、新たな物質の生成が確認された。今後は、本物質の構造解析を行うことで、NO除去活性を示しているのか確認していきたいと考えている。一方今年度も、腸内細菌およびヒト細胞の組み合わせによる「共培養法」により産生する代謝物の解析を継続した。昨年度、マクロファージ様細胞J774.1およびSporolactobacillus inulinusの組み合わせにより産生される物質として、Indole-3-carboxyaldehydeを発見した。本物質は、生産の再現性が得られなくなってしまったものの、他の物質が再現性よく産生されることがわかったため単離・構造解析を試みた。その結果、バクテリアからは初の発見となるPyranonigrin Aの産生が確認されたため、本物質の産生機構の解析を試みた。各種検討の結果、J774.1が産生するタンパク質もしくはペプチド様物質が本化合物の産生を促進することが示唆された。今後は、本活性化因子の特定を試みるとともに、本分子が他の腸内細菌の二次代謝能に与える影響について評価していきたいと考えている。
This year, we analyzed the immune function inhibitory mechanism of (S)-3-hydroxy-3-(2-oxopropyl) indolin-2-one, which was discovered from Clostridium strain. This compound has been shown to suppress the production of the inflammatory mediator, nitric oxide (NO), produced by LPS stimulation. Hence, the effect on the expression level of NO synthase (iNOS) was evaluated by RT-PCR and Western blotting. However, since significant change was not observed in iNOS expression, the compound was expected to have iNOS enzyme inhibitory activity or NO scavenging activity. First, when this compound and NO reacted in a test tube was analyzed by LC/MS, generation of a new substance was detected. In future, we would like to confirm whether it exhibits NO removal activity by conducting structure determination of this substance. Furthermore, this year, we continued to analyze the metabolites produced by the "co-culture method" by combining intestinal bacteria and animal cells. Last year, we discovered indole-3-carboxyaldehyde as a substance produced by a combination of macrophage-like cells J774.1 and Sporolactobacillus inulinus. Although the production reproducibility of this substance could not be obtained, it was found that another substance was produced. As a result of isolation and structural determination, we confirmed the production of pyranonigrin A, which was the first discovery from bacteria, and attempted to analyze the production mechanism of this substance. After various considerations, it was suggested that the protein or peptide-like substance produced by J774.1 promotes the production of this compound. In future, we would like to try to identify this activator and evaluate the effect of this molecule on the secondary metabolism of other intestinal bacteria.