イノシトール（4, 5）2リン酸（PIP2）は生体膜に存在し、様々なタンパク質と結合することでシグナル伝達や細胞の形態形成などの生理機能を担う。したがって、PIP2結合タンパク質がどのようにして細胞膜中のPIP2を認識するのかを解明することは、生命現象の理解につながる。そこで本研究では、ビンキュリンのtailドメイン（Vt）とPLCδ1のPHドメイン（PLCδ1 PH）を実施例として、PIP2含有リポソームとの相互作用を定量的に調べた。その結果、VtとPLCδ1 PHではPIP2との結合様式が異なり、Vtは細胞膜中のPIP2の割合を上げると結合率が急激に上昇したことから、PIP2認識に正の協同性があることが分かった。そこで、このVtの協同的PIP2認識様式の構造基盤を得るため、NMR法によるVtとPIP2含有ナノディスクの相互作用解析を行った。
まず、VtのNMRシグナルの帰属を行った。Vtの分子内に12個存在するIle残基を1個ずつ別の残基に置換した変異体を調製し、Ileのメチル基を選択的に1H, 13Cで、それ以外を2H, 12Cで標識したVtのNMR測定を行うことにより、各シグナルを帰属した。Vtに対してPIP2を含まないナノディスクを添加した場合にはスペクトル変化がほとんど観測されなかったが、PIP2含有ナノディスクを添加した場合にはサンプルが白濁し、一部のシグナルに広幅化や化学シフト変化が観測された。以上より、VtがPIP2と相互作用し、一部は沈殿したことが分かった。ナノディスク中のPIP2濃度を1%または4%として行った実験結果を比較すると、1%の場合にはナノディスク添加量の増加に伴うシグナル特異的な広幅化が確認されたが、4%の場合には0.25当量のナノディスク添加時点で多くのシグナルが消失し、残基特異的な解析は困難であった。1%PIP2含有ナノディスクとの相互作用により影響を受けたIleは、I919、I920、I954、I988であり、これらの残基がナノディスク中のPIP2との相互作用に関与していることが示唆された。
Phosphatidylinositol 4,5-bisphophate (PIP2) is a component of biological membranes and is responsible for physiological functions such as signal transduction and cell morphogenesis by binding to various PIP2-binding proteins. Therefore, elucidating how each PIP2-binding protein recognizes PIP2 within membranes leads to better understanding of PIP2-related physiological events. In this study, we prepared a tail domain of vinculin (Vt) and a PH domain of PLCδ1 (PLCδ1 PH) and quantitatively analyzed the interaction between each protein and PIP2-containing liposomes, indicating that Vt binds to PIP2 in liposomes with positive cooperativity. To gain structural basis for the cooperative PIP2-binding mode of Vt, we performed NMR analyses of the interaction between Vt and PIP2-containing nanodisc, a membrane mimetic suitable for NMR.
To use Ile-delta1 methyl groups of Vt as a probe to determine PIP2 binding site on Vt, each of twelve Ile residues of Vt was mutated to another residue and their assignments were confirmed based on their NMR spectra. When nanodiscs without PIP2 were mixed with Vt, Ile signals of Vt were not perturbed. On the other hand, several signals were perturbed upon addition of PIP2-containing nanodiscs and the sample become cloudy, indicative of precipitation. Thus, it was confirmed that Vt bound to PIP2 in nanodiscs, and precipitated in part. When using nanodiscs containing PIP2 with a ratio of 4%, most of the signals disappeared upon addition of 0.25 molar equivalent of nanodiscs to Vt, therefore residue-specific changes were not observed. On the other hand, upon addition of nanodiscs containing PIP2 with a ratio of 1%, intensity reduction of the Ile methyl signals was specifically observed for I919, I920, I954, and I988, suggesting that these Ile residues were involved in the interaction with PIP2 in nanodiscs.