単一分子DNAシーケンサへの応用を目指し、単一塩基分解能・感度による表面増強ラマン分光の実証に継続して取り組んだ。水中で自然形成される金ナノ粒子二量体の空隙に短鎖DNAを挟み込み、空隙での電場増強効果を活用したラマン計測を実施した。測定対象としては、主に25塩基長のシトシン（C）の中央をグアニン（G）一塩基で置き換えたオリゴヌクレオチド（CGCと表記）を使用した。CGCを直径40 nmの金ナノ粒子に吸着させると同時に、塩を加えることによりCGCを挟み込んだ二量体形成を促した。またCGCの吸着効率、ならびに二量体形成効率を高めるために、酸性環境下で実験を行った。酸性環境下ではシトシンがプロトン化し、金ナノ粒子との反発が抑制される。二量体形成時の温度を25℃から90℃の範囲で変化させ、ラマン分光測定の結果を比較した結果、70～90℃においてシトシン、グアニン由来の強いラマンピークが得られることが明らかとなった。単一金ナノ粒子二量体からのラマンスペクトルを大量に取得したところ、全スペクトルのうち9%においてグアニンのみ、12%においてシトシンのみ、10%において両者のラマンピークが確認された。シトシンと同程度の確率でグアニンのみのピークが得られたという事実は一塩基分解能の達成を実証している。
実験と並行して、計測対象となるDNAを金ナノ粒子二量体空隙に効率的に引き込む機構を、散逸粒子動力学シミュレーションにより検討した。金ナノ粒子表面を親水性ポリマーと疎水性ポリマーで修飾したヤヌス粒子を想定し、まず、ポリマー修飾密度と疎水性ポリマーの被覆率の関数として、自然形成される二量体の粒子間距離を見積もった。粒子間距離は系統的に変化し、ポリマー密度が低く、疎水性ポリマーの被覆率が高いほど、粒子間距離の小さい理想的な二量体が形成できることがわかった。続いて、空隙にDNAが存在する確率（引き込まれている確率）を被覆率の関数として見積もったところ、被覆率の上昇とともに存在確率は上昇し、被覆率50%において存在確率は35%に達するという結果が得られた。
Aiming for application to single-molecule DNA sequencing, we have demonstrated surface-enhanced Raman spectroscopy of oligonucleotides with single-base resolution and sensitivity. An oligonucleotide was sandwiched in the gap of a gold nanoparticle (AuNP) dimer naturally formed in water, and Raman scattering spectroscopy was attempted utilizing the electric field enhancement in the gap. As a target DNA, an oligonucleotide (denoted as CGC), in which the center of cytosine (C) having a length of 25 bases was replaced with a single base of guanine (G) was mainly used. CGC molecules were adsorbed on the surface of AuNPs with a diameter of 40 nm and simultaneously dimerization of AuNPs was promoted by adding salt. The adsorption efficiency of CGC molecules and dimerization efficiency were enhanced under acidic pH condition because most of cytosines are protonated, suppressing the repulsion with AuNPs. We examined Raman spectroscopy of single AuNP dimers, which were formed at the temperatures from 25℃ to 90℃ and found that Raman peaks originating from cytosine and guanine were stronger at higher temperature (70℃-90℃). After the measurement of hundreds of Raman spectra, we also found that only the guanine peak was observed in 9% of Raman spectra, only the cytosine peak in 12%, and both peaks in 10%. The fact that Raman spectra involving only the guanine peak were obtained with probability as high as those involving only the cytosine peak demonstrates the single-base resolution.
In parallel with the experiment, we conducted dissipative particle dynamics simulation to investigate mechanism to effectively attract target DNA molecules into the AuNP dimer gap. By employing a Janus particle having hydrophilic and hydrophobic polymers on the AuNP surface, we evaluated the gap distance of AuNP dimer spontaneously formed as a function of polymer density and coverage of hydrophobic polymer. We found that lower polymer density and higher coverage of hydrophobic polymer enable to form a AuNP dimer with a smaller gap distance, which is favorable for the field enhancement. Based on the result, we calculated the probability to find the target DNA molecule in the dimer gap for various coverages of hydrophobic polymer. The probability increases with the coverage, reaching to 35% at the coverage of 50%.
|
