炎症性腸疾患(IBD)は、原因不明の慢性的な経過をたどる腸管の難治性炎症性疾患であり、抗TNF療法を初めとした分子標的療法の開発により治療成績が向上した現在においても、未だ根治療法は存在せず、根治的治療法の開発は急務である。抗TNF療法の重要なターゲットの1つであるT helper(Th)細胞のうち、転写因子RORγtを発現しIL-17を産生するTh17細胞は、腸管に特に豊富に存在することが知られているが、その病態への関与については不明な点が多い。腸管Th17細胞の詳細な機能解析から腸炎の新規発症メカニズムを解き明かすために、マウス腸管Th17細胞を1細胞遺伝子発現解析法 (scRNA-seq)を用いて解析し、炎症惹起性Th17細胞特異的に発現する遺伝子群を追求し、新たな炎症性腸疾患治療ターゲットの探求を目指すために、本研究を実施した。
具体的には、マウス小腸および大腸腸管粘膜固有層より白血球を抽出し、Flowcytometry (FACS ARIA, BD bioscience)によりTCR-beta+ CD4+分画(Th細胞分画)を単離した。得られたTh細胞を用いて、約10000個の細胞をターゲットとして、Chromium system(10x Genomics)を用いて、細胞ごとにRNA抽出、cDNA合成を行い、scRNA-seqのライブラリ作成を行った。ライブラリのシーケンスを行い、Cell Rangerパイプライン(10x Genomics)を用いてsequence後のunbiasedに解析を行い、腸管内Th細胞を遺伝子発現パターンの類似するグループごとに分類したところ、Th17細胞は５種類のサブクラスターに分類されることが明らかとなった。注目すべきことに、Th17細胞には、IL-10やFoxp3を発現する炎症抑制性遺伝子を発現するクラスターとIFN-gなどTh1細胞に特徴的な遺伝子を発現するクラスター、そして、IL-17を専門的に発現するクラスターが存在することが明らかとなり、今後これらのグループ間で異なる発現パターンの遺伝子を抽出し、各グループの特性評価を行うことで、既存の知識にとらわれない新規Th細胞サブセットや遺伝子発現を特定することにつながる有意義な検討となったと考えられる。
Inflammatory bowel disease (IBD) is an intractable inflammatory disease of the intestinal tract with a chronic course of unknown aetiology, and even though the development of molecular targeted therapies such as anti-TNF therapy has improved the outcome of treatment, there is still no cure and the development of a curative treatment is urgently needed. Th17 cells, which express the transcription factor RORgt and produce IL-17, are known to be particularly abundant in the intestinal tract, but their involvement in pathogenesis remains unclear. In order to elucidate the novel pathogenesis of intestinal inflammation from a detailed functional analysis of intestinal Th17 cells, we analyzed mouse intestinal Th17 cells using single-cell gene expression analysis (scRNA-seq) to identify genes that are specifically expressed in inflammatory Th17 cells and to explore new therapeutic targets for inflammatory bowel disease. The aim of this study was to identify genes that are expressed specifically in inflammatory Th17 cells and to explore new therapeutic targets for inflammatory bowel disease.
Specifically, leukocytes were extracted from the intrinsic layer of the intestinal mucosa of mouse small and large intestine and TCR-beta+ CD4+ fraction (Th cell fraction) was isolated by Flowcytometry (FACS ARIA, BD bioscience). Using the obtained Th cells, RNA extraction and cDNA synthesis were performed for each cell using Chromium system (10x Genomics) to create a library for scRNA-seq, targeting about 10000 cells. The library was sequenced and unbiased analysis was performed using the Cell Ranger pipeline (10x Genomics) to classify intestinal Th cells according to groups with similar gene expression patterns. Th17 cells were found to be classified into five subclusters. Notably, there are clusters of Th17 cells expressing pro-inflammatory genes such as IL-10 and Foxp3, clusters expressing genes characteristic of Th1 cells such as IFN-g, and clusters specifically expressing IL-17. This study will be useful to identify novel Th cell subsets and gene expression patterns that are not restricted by existing knowledge by extracting genes with different expression patterns among these groups and characterizing each group.
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