成長因子の一つであるトランスフォーミング成長因子（TGFb）は多様な生理活性機能を有している。本研究では、棘皮動物イトマキヒトデ胚を用い、TGFbの機能特性の解明を目的とした。
（１） イトマキヒトデ後期原腸胚から単離したTGFb(PpTGFb）はLAPとTGFbが結合した複合体構造としてコードされている。
（２） 無細胞系で合成したPpTGFbリコンビナントタンパク質は、還元状態下でのウエスタンブロットでは約48kDaのバンドとして検出される。
（３） 後期原腸胚を用いたin situハイブリダイゼーション法下では、PpTGFbは身体の全ての部位の上皮細胞と間充織細胞に発現していた。
（４） モルフォリノオリゴを用いたPpTGFbのノックダウン個体（PpTGFbモルファント）は、受精4日後には体のサイズが僅かに小さくなっていたが、形態的な不全は認められなかった。
（５） このPpTGFbモルファントの細胞数は、約７５％でしかなかった。
（６） 間充織細胞に強く発現するアスタチン属のメタロプロテアーゼであるPpMC5のノックダウン個体と実験対照であるCMO個体から受精4日目に乖離細胞を得た。これらをPpTGFbリコンビナントタンパク質とインキュベートしたところ、 CMO個体のサンプルでは明らかにPpTGFbが分解されていたが、MO個体由来のサンプルでは分解が抑制されていた。
（７） 上記（６）のCMO個体とのインキュベーションにより生じたと推定される分解産物を、モルフォリノオリゴによるPpMC5欠失が誘導された初期原腸胚の胞胚腔に注入した。4日幼生に到るまで飼育を続け、その影響をみたところ、胚体サイズが増加するのみならず、構成細胞数も有意差を持って増加していた。
以上の結果から、ヒトデ胚のPpTGFbは細胞増殖に関与しており、その前段階としてPpMC5によって活性化される必要があることが示唆された。これにより、間充織細胞が上皮細胞の増殖を誘起している実態もイメージできるようになった。
Transforming growth factor (TGFb) has various physiological activities. Present study aims to examine TGFb's functional characteristics and mechanism activated by PpMC5 (astacin metalloprotease) during development of the starfish, Patria pectinifera. Obtained results as follows.
(1) We identified an inherent TGFb from late-gastrulae of P. pectinifera, and referred to this as PpTGFb (GenBank accession No. 528218).
(2) PpTGFb encodes 450-amino acid polypeptides with 45kDa of theoretical molecular weight, and its deduced sequence reveals an inactivated (latent) form consisting of leader sequence, LAP and TGFb1.
(3) PpTGFb was indeed expressed in the epithelial and mesenchyme cells of whole body of late-gastrula embryos.
(4) In PpTGFb morphant (400 µM, morpholino-oligo; MO) on 4-day-old bipinnaria larva, a little decrease of larval size (approximately 10% decrease of control CMO-larvae) occurred without any morphological irregularities.
(5) In compared to control CMO-larvae, cell numbers of PpTGFb morphant shown in (4) decrease is approximately 20-25%.
(6) When PpTGFb is incubated with dissociated cells of PpMC5-MO or PpMC5-CMO bipinnaria larvae, the resulting products were proteolytically degraded only in samples of PpMC5-CMO. On the other hand, an apparent inhibition of proteolysis of PpTGFb occurs in the PpMC5-MO samples.
(7) MO of PpMC5 elicits larval size decrease. In PpMC5 morphants on 4-day-old bipinnaria larva, which the degraded samples of PpTGFb has injected into the blastocoel at the early gastrula-stage, decrease of larval size was significantly rescued. This is contrasted to control experiment. These observations were corroborated in quantifications of cell numbers.
Together, our results suggest that PpTGFb participates in induction of cell proliferation and that it is necessary for PpTGFb to be proteolytically activated by PpMC5 prior to work.
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