酸化還元酵素を用いたバイオ電池は環境負荷が少ないエネルギー生産システムとして注目されているが、出力が低く寿命も短いため実用化には至っていない。そこで、進化工学による酵素の活性および安定性の向上に向けて、当研究室では、µTASを用いた酸化還元酵素の独自のスクリーニング系の開発が進められてきた。このスクリーニングシステムは３つのマイクロ流体デバイスからなる。まず、「区画化用デバイス」により、NAD(P)依存性酸化還元酵素とその遺伝子を固定した磁性ビーズを１個ずつ含むように区画化した酵素反応液を作成し、各区画内で独立に酵素反応を行う。次に、「検出用デバイス」により、ビーズ上の酵素活性により生じた各区画ごとのNAD(P)Hの酸化電流値を導電性ダイヤモンド（BDD）電極により自動連続測定する。最後に、誘電泳動を利用した「選別用デバイス」により、活性が高い酵素を固定しているビーズを含む液滴を選別・回収する。本研究では、このスクリーニング系を用いて、TCA回路を構成するイソクエン酸デヒドロゲナーゼ（IDH）の進化実験をおこなった。
まず、マイクロビーズディスプレイ法を用いて、IDH遺伝子を固定したビーズをエマルション内で無細胞転写翻訳し、酵素とその遺伝子を固定したビーズを作製した。その後、区画化デバイスによって作製された液滴内で酵素反応を行い、活性測定デバイスに内蔵されているBDD電極によって活性を測定できることを確認した。次に、誘電泳動を用いた選別デバイスにより回収したビーズに固定されているIDH遺伝子をPCRにより増幅することで、活性をもつIDH遺伝子を含む液滴を回収できることを確認した。最後に、error-prone PCRによってIDH遺伝子にランダム変異を導入したライブラリーを作製し、集団としての酵素活性が低下していることを確認した後、実際に誘電泳動を用いて選別実験を行った。その結果、選別した変異体ライブラリーでは集団としての酵素活性が回復したことから、我々のµTASによって活性を有する変異体酵素遺伝子をライブラリーから選別できることが確認できた。ライブラリー中のクローンの配列と活性を解析した結果、野生型よりも高い活性をもつ変異体も含まれていた。
Although biofuel cells using oxidoreductases have attracted attention as a power generation system with a small environmental burden, they have not been put into practical use yet due to problems of low output and lifetime. As means for increasing the activity and stability of enzymes, we focused on an evolutionary engineering approach through the development of microfluidic devices for high-throughput screening of oxidoreductases. Our µTAS are composed by three microfluidic devices. First, the encapsulating device makes compartments. One microbeads is encapsulated in each droplet, in which the enzyme reaction occurs. Second, the quantity of NADH in each droplet are detected by the NAD(P)H-measuring device that includes boron-doped diamond (BDD) electrodes. Third, we developed the dielectrophoretic sorting device for whole droplets that contained microbeads. In this study, we applied our screening system to directed evolution of isocitrate dehydrogenase (IDH) consisting of TCA cycle.
First, we constructed the IDH enzyme- and DNA-immobilized microbeads by in vitro transcription and translation in emulsion, and confirmed the activity of IDH that immobilized on microbeads by using microfluidic devices having BDD electrodes. Next, we tested the sorting device by PCR amplification of DNA that immobilized on microbeads after selection and collection. We succeeded in sorting droplets including the enzyme- and DNA-immobilized microbeads using the dielectrophoretic sorting device. Finally, we performed screening of a randomly-mutated IDH library constructed by error-prone PCR. The activity of almost mutant enzymes in the initial library was decreased by random mutation in comparison with the wild-type IDH. After dielectrophoretic sorting, the collected DNA in 'High' fraction was amplified by PCR and was used as a template for protein synthesis. The activity of the resulted enzyme library was recovered to the wild-type level, indicating that active enzyme genes in the library were successfully enriched by our µTAS. When we analyzed the sequence and the enzyme activity of randomly-chosen IDH clones, some mutants have higher activity than the wild-type.
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