中枢神経系において, 神経活動が亢進するとシナプス近傍の細胞外でCa2+等の濃度が一時的に変化することが知られているが, その機能的意義については不明な点が多い。δ2型グルタミン酸受容体(GluD2)は小脳平行線維シナプスに存在し, Dセリンと結合してシナプス可塑性を制御するが, 細胞外領域にCa2+結合部位を持つ。近年, in vitro実験からGluD2のDセリンに対する親和性は細胞外Ca2+濃度に依存することが報告された(Hansen et al. 2009, J Neurosci.)。このことは小脳平行線維シナプスの可塑性がDセリンだけでなく, 細胞外Ca2+濃度にも制御されている可能性を示唆している。本研究は, GluD2をモデルに神経活動による細胞外Ca2+濃度変化がDセリン―GluD2シグナリングへ及ぼす影響を解析し, 新規シナプス制御機構を明らかにすることを目的とした。そのためにはGluD2のCa2+に対する結合能を操作した遺伝子改変マウスを作製する必要がある。そこで本年度は主にGluD2に点変異を導入したノックインマウスの作成を行った。変異導入部位については, Hansen et al. (2009)に従い, ①D782AによってCa2+結合能を欠損したGluD2, ②E521C及びD782Cによって常時Ca2+結合状態を模倣したGluD2を設計した。ノックインマウス①について, 標的塩基配列を含むガイドRNAを3種類作製し, それぞれCas9 mRNA及びドナーDNAと共に野生型マウスより採取した受精卵にインジェクションした。生まれてきた仔に対してシーケンス解析した結果, 一部にノックインホモマウスを確認した。ノックインマウス②についてはエクソンの異なる2か所に変異を導入するため, 変異導入を2回に分けて行う方法を採った。本年度はまず1点目としてD782 Cの変異導入をノックインマウス①と同様の方法で行い, ホモマウスが生まれた事を確認した。今後, ホモマウスから採取した受精卵を使って2点目のE521Cの変異導入を行い, ノックインマウス②を作成する予定である。
It has been well-known that extracellular Ca2+ concentration ([Ca]o) at synapse can change by neural activity in the central nervous system. However, the functional significance of this [Ca]o dynamics in synaptic transmission is still elusive. Delta 2 glutamate receptors (GluD2), that are expressed at cerebellar parallel fiber – Purkinje cell synapse (PF-PC synapse), has been reported to regulate synaptic plasticity by binding to D-serine. It has been reported that GluD2 has Ca2+ binding site near its ligand binding domain, and that the affinity of GluD2 to D-serine can be influenced by [Ca]o (Hansen et al. 2009, J Neurosci.). This suggests that the synaptic plasticity at PF-PC synapse can be regulated not only by D-serine but also by [Ca]o. In this study, using D-serine-GluD2 signaling at PF-PC synapse, I aimed to investigate the possibility of the synaptic transmission being regulated by the [Ca]o dynamics. For this aim, in this year, I tried to produce two knock-in (KI) mice which have mutations in GluD2 by CRISPR/Cas9 system; (1) D782A single mutation to impair Ca2+ binding ability, and (2) E521C and D782C two points mutation to mimic constitutive Ca binding state. Regarding KI mouse (1), KI homo mice were already obtained successfully. KI mouse (2) is in the process of production but will be obtained soon.
|
