質量分析技術の隆盛により, 代謝物測定技術が発達し, 生体内の代謝特性を容易に把握することが可能になった。核内におけるメチル基ドナーやアセチル基ドナーに代表されるように細胞局所での微小環境の重要性が認識され始めたが, 現状では細胞内の代謝物分布を捉える事は難しく, どのように制御されるかという包括的な研究はなされてこなかった。本研究では, 解糖系酵素と微小管との相互作用という現象に着目し, 細胞局所におけるエネルギー代謝が及ぼす微小管ダイナミクスの変化ががん細胞の化学治療抵抗性獲得のメカニズムを明らかにすることを目指す。
研究計画1年目の本年度は, 主に解析ツールの作製に時間を割いた。微小管重合阻害剤であるパクリタキセル耐性株をin vivoにて作成するため以下の系を構築した。乳がん細胞株MDA-MB-231細胞をヌードマウスに接種し, 腫瘍の成長後にパクリタキセルを複数回投与, 一定期間後に腫瘍を摘出, 細胞を単離した。この操作を3回繰り返し, その都度投与するパクリタキセル濃度を上げることで, 耐性株を複数種樹立した。得られた耐性株と非耐性株を比較したところ, 耐性株では微小管の修飾動態が大きく異なる上に, 以前我々が報告した解糖系酵素のメチル化修飾が亢進していることが明らかになった。
次に我々は, 解糖系酵素と微小管との相互作用をモニタリング可能にした発現ベクターの設計・構築を行なった。担体や蛍光プローブとの共有結合が可能なツールであるHaloタグをチューブリンのアミノ末端に連結することで, 微小管と解糖系酵素のアフィニティの変化およびその可視化を可能にした発現ベクターを作成した。次年度は今年度構築したツールを活用し, 修飾操作による細胞骨格ダイナミクス制御の検証実験を行ない, 人為的に局所でのエネルギー代謝を操作することを予定している。
Advances in metabolomics technology allowed us to understand the characteristics in many types of organs and cells. Nowadays, it has been recognized that local metabolism in the nucleus affects gene regulation through posttranslational modification (PTM) of transcriptional factors. However, we haven't obtained the methodology to survey the spatial information for cellular metabolism in microenvironment yet. In this study, We focused the interactions between glycolytic enzymes and cytoskeleton to migrate for metastasis in cancer cells. The aim of this study is to be elucidated the mechanism which local energy metabolism affects the dynamics of cytoskeleton for the migration.
We spent time to make several tools for the progression of this study in this academic year. Firstly, we established Paclitaxel-resistant cells in vivo. Paclitaxel is one of several cytoskeletal drugs that target tubulin and used as an anti-cancer drug against many types of cancer. We injected MDA-MB231 breast cancer cells into nude mice. After transplantation, we administrated the drug intraperitoneally three a week for a month. By repeating this step 3 times, we obtained several paclitaxel-resistant cell line. Our preliminary observation showed that modification levels of glycolytic enzymes in resistant cells were higher than control cells.
Next, we designed and constructed dual expression vector for each of tubulin subunits (alpha and beta), which is easy to manipulate the protein tags. This tools allow us to analyze the spatial patterns and affinity between glycolytic enzymes and cytoskeleton in next year.