本研究の目的は, 微生物細胞のような微小体積の空間で生じる確率的な生化学反応系のダイナミクスを, 制御理論や遺伝子組み換えの技術を用いて体系的に設計・構築するためのモデルベースの設計理論と実験基盤を提案することである。
本年度は, ①確率モデルに基づいて望みの反応を設計するための数理最適化アルゴリズムと②遺伝子回路のダイナミクスを人工的にコントロールされた環境下で観察するための実験系の2つを並行して構築した。
①では, 確率モデルに基づいて, 反応に関与する分子の個体数の平均値, 分散, CVなどの統計量を望みの値に収束させるための遺伝子回路の設計ツールを構築した。具体的には, 平成28年度に開発した「確率モーメントの厳密な計算法」を発展させることで, 分子個体数の確率モーメントが所与の設計仕様を満たすために必要な設計パラメタ空間(反応率など)を, 数理最適化に基づいて効率的に探索するためのアルゴリズムを開発した。確率的にゆらぐ反応系の設計は, 従来, 近似シミュレーションに基づくものがほとんどであったが, 提案法は, 仕様を満たすパラメタを厳密に同定することができるため, よりロバストな設計が実現可能になると期待できる。そこで, 提案法の有用性を実証するために, 実験で実現可能な遺伝子回路の設計問題を考え, 確率ゆらぎを効率的に低減するための負帰還反応系のパラメタを明らかにした。これらの成果をまとめ, 国際会議論文とジャーナル論文を出版することができ, 米国の研究グループとの共同研究へと発展させることができた。
②では, 指定された濃度のDNAや低分子化合物を動的に入力可能なナノリットルスケールの反応容器を持つマイクロ流路デバイス(平成28年度開発)の改良を行い, 入力量の精密な制御を行うことが可能となり, フルオレセイン溶液を用いた実証実験を行った。さらに, 遺伝子回路のDNAサンプルを用いて同様の実証実験を行うために, 必要なプラスミドDNAを用意し, 無細胞タンパク質合成系を用いて予定通りの遺伝子発現が得られることを確認できた。
The kinetics of chemical reactions in micro-scale compartments such as biological cells are known to be highly stochastic due to the low copy nature of molecules in the compartment. The objective of this research is to develop both theoretical and experimental platforms to analyze and design the dynamics of stochastic biomolecular reactions by combining feedback control theory and genetic engineering.
In FY 2017, we developed (1) a mathematical optimization algorithm for model-based design of stochastic biomolecular reactions, and (2) an experimental platform to measure the dynamics of genetic circuits in a controlled microfluidic environment.
Specifically, we proposed a computational design tool that systematically scans the parameter space of reactions and finds the set of parameters with which the copy number of molecules converges to pre-specified values of the mean, the variance and the coefficient of variation, which is an extension of a moment computation method that we developed in FY 2016. The proposed approach allows for the characterization of the parameter space without approximation and/or a priori knowledge of the underlying stochastic distributions of molecular copy numbers. We demonstrated the proposed algorithm by designing a negative feedback biomolecular circuit and revealed the parameter space with which the noise attenuation is achieved. These results are published in an international conference proceedings and an international journal.
We have also developed a nano-liter scale microreactor that enables dynamic input modulation of chemicals and demonstrated with fluorescein solution. This technology will potentially enable frequency response characterization of biomolecular reactions. For this goal, we prepared plasmid DNAs and confirmed in vitro gene expression using a cell-free protein expression system.