ハイブリドーマのクローニングを行い、抗ヒトアクアポリン４（AQP4）に対する結合活性のある５クローン（❶〜❺）得た。ハイブリドーマを増幅する過程においてその上清から抗体を精製し、AQP4の２つのアイソフォームであるM1（アレイ構造を形成しない）あるいはM23（アレイ構造を形成する）を発現するCHO細胞、およびM1とM23を共に発現するCHO細胞を用いてELISA法により平衡状態における結合特性を確認したところ、２クローン（❶と❺）はほぼ同一のパターンを示したため、抗体遺伝子クローニング、シークエンス解析を行ったところ、H鎖に２残基の置換が見られたものの、ほぼ同一の抗体であることが確認された。また残りの３クローンのうち１クローン（❹）は他のクローンと比較するとAQP4に対する親和性が低かった。よってこの２クローンについては以後の解析には用いなかった。
選択した３クローン（❶、❷、❸）のうち、❷が最もM1に対する結合活性が強い一方、❸はM1にはほぼ結合しなかった。これら３クローンをHRPで標識し、M1とM23を共に発現する細胞を用いて解離実験を行ったところ、❶と❷は、容液中の抗体濃度を上昇させても溶液中の抗体を除去した場合と同様ゆっくりとした速度で解離したため、一度アレイ構造上で二価結合が形成されるとその状態が長く維持されることが示唆された。一方、❸は他の２クローンと比較すると、溶液中の抗体濃度を上昇させることにより解離が促進されたが、既存抗体と比較すると長時間結合が維持された。
AQP4ヒト化ラットから初代培養アストロサイトを採取し、上記３抗体によるAQP4のエンドサイトーシス誘導を調べたところ、❶と❷は極めて強くAQP4のエンドサイトーシス・ライソゾームでの分解を誘導したのに対し、❸はほとんど誘導しなかった。
以上より既存抗体と比較してヒトAQP4に対する親和性の高い、結合特性の異なる３種類の抗体を得ることができた。次年度以降、これらの抗体を用いて現在開発を進めているモデルによりNMOSDの新規治療薬の開発を進める。
We obtained five hybridoma clones and purified monoclonal antibodies from their culture media. We examined their binding properties against the extracellular domains of human AQP4 by ELISA using CHO cells expressing either M1, which does not form orthogonal arrays of particle (OAPs); M23, which forms OAPs; or both M1 and M23. Two clones (❶ and ❺)showed almost the same binding patterns. Cloning and sequencing their cDNAs for heavy chains revealed that they are almost the same molecules except for the difference in two amino acids. Among other three clones, one (❹) showed relatively low affinity against the extracellular domains of AQP4. Thus, we did not use clones ❹ or ❺ for further analysis.
We found that clone ❷ has the greatest capacity to bind to the M1 isoform. In contrast, ❸ little bound to M1. We labeled clones ❶, ❷, and ❸ with HRP and performed dissociation experiments by ELISA using CHO cells expressing both M1 and M23. Binding of ❶ and ❷ to AQP4 lasted for long time even in the presence of high concentration of antibody in the buffer, which was comparable to the dissociation rate in the absence of antibody. The result indicates that for these antibodies, once bivalent binding to AQP4 is achieved on AQP4 OAPs, the state will last for long period. On the other hand, high concentration of antibody in the buffer enhanced dissociation of ❸ from AQP4; however, the binding of ❸ to AQP4 maintained longer as compared with that of another antibody established previously.
We also examined an ability of the antibodies to induce endocytosis of AQP4 using primary cultured astrocytes collected from brains of newborn AQP4-humanized rats. We found that ❶ and ❷ strongly induced endocytosis and transportation of AQP4 to lysosomes to be degrade, whereas ❸ did not.
Taken together, we established three new monoclonal antibodies strongly bind to the extracellular domains of human AQP4 having different binding properties. Using these antibodies, we will proceed with establishment of a new therapeutic drug for neuromyelitis optica spectrum disorder using a new models we have established.