両生類胚へのmRNAの顕微注入は特定の遺伝子の発生現象に対する機能評価を迅速且つ正確に行える最良の手法の一つである。本研究室では, 二量体形成型転写因子の核移行を阻害する手法として, C末端にペルオキシソーム移行シグナルであるSKL配列を追加することが考案されていたが, その十分な評価が行われていなかった。また, 胚の収斂伸長運動(CE : convergent extension)に関わる遺伝子のスクリーニングにおいて, 伸長に関わることが期待される遺伝子としてR-Ras2が得られていたが, その評価は行われていなかった。そこで私は, これらの評価研究に取り組むことにした。
SKL配列付加の有効性については, 原腸胚期の腹側領域において発現するVent2遺伝子を対象とした。まず, Vent2のC末端にSKLを付加したVent2-SKLをコードする遺伝子の全長を委託合成し, そこからSKL配列を取り除いたものも作成して, それぞれをmRNA合成に適したpCS2プラスミドにサブクローニングした。そして, そのmRNAを合成し顕微注入をしたところ, Vent2-SKLは本来のVentの働きを失っているだけでなく, 微弱ながらも背側化させることが判明した。
R-Ras2の機能評価については, 予め作成されていたR-Ras2とdominant negative型となるR-Ras2のそれぞれをコードする遺伝子が含まれたプラスミドからmRNAを合成し, それぞれをツメガエル胚に顕微注入した。その結果, どちらの場合においても, 胚の伸長に対して顕著な阻害を引き起こすことが確認された。
以上の結果より, SKL付加による二量体転写因子の核移行阻害についてはその有効性が示唆された。そしてR-Ras2についてはCEに関わる新しい遺伝子であることが示されたと言える。
|
