記憶や学習を含む高次の脳機能は、神経細胞が構築する複雑な神経回路によって支えられている。シナプスは神経細胞同士の繋ぎ目であり、神経細胞間の情報伝達としてシナプス伝達がおこなわれている。脳には興奮性と抑制性のシナプスが存在し、さらにそれぞれが入力や構造からさまざまな種類に分類される。シナプスは脳が機能する上で必須の構造であり、その異常は発達障害や精神疾患などさまざまな脳疾患の原因となることから、シナプスの形成や機能を制御する分子メカニズムの解明が、今強く求められている。
シナプスは情報を伝える側（プレ）と情報を受け取る側（ポスト）によって構成されている。申請者は、近年、研究分担者である高野博士によって開発された分割型ビオチン化酵素（Split-TurboID）を、プレとポストにそれぞれ発現させることで、任意のシナプスを特定し、その構成因子を標識することが可能であると考えた。本研究では、実際にこの方法によって特定のシナプス構成因子を標識・精製可能であることを実証し、その構成因子を網羅的に同定することを目的とした。
はじめに、申請者の所属する柚﨑研究室で長く研究対象としている小脳プルキンエ細胞と小脳顆粒細胞から伸びる平行線維が形成する興奮性シナプス（PF-PCシナプス）をターゲットとし、ツールの構築をおこなった。Split-TurboIDのNT側をL7プロモーター下に組み込んだAAVとCT側をCre-依存的Synプロモーター下に組み込んだAAVを作成し、マウスの小脳に感染さ、その細胞特異的な発現を確認した。今後は、PF-PCシナプスの標識の確認とそれぞれの発現量最適化を行い、シナプス構成因子の精製を予定している。
また、小脳に存在する分子層介在神経細胞（MLI）とPCの作るシナプスについてもシナプス標識を行うため、tet-offシステムと特異的プロモーターをAAVに組み込んだMLI特異的発現系を作成し、MLI特異的な遺伝子発現系を確立することができた。現在は、このAAVにCT側のSplit-TurboIDを組み込んだAAVを構築をおこなっている。
Higher brain functions, including memory and learning, are regulated by complex neuronal circuits. Synapses are the connections between neurons, and synaptic transmission is used to transmit information between neurons. There are excitatory and inhibitory synapses in the brain, which can be further classified to various types based on their input and structure. Synapses are essential for the brain to function, and their abnormalities can cause various brain disorders such as developmental disorders and psychiatric disorders.
Synapses are composed of a transmitter (pre) and reciever (post). We hypothesized that a newly developed method by Dr. Takano (a collaborator of this project) called split-turboID can detect a specific synapse type, and label its components. In this study, we aimed to demonstrate that it is possible to label and purify the components of a specific synapse by this method, and to identify the components comprehensively.
First, we constructed viral constructs targeting excitatory synapses formed by Purkinje cells and parallel fobers of cerebellar granule cells (PF-PC synapse), which has long been the target of research in Yuzaki lab. AAV with the NT side of Split-TurboID under the L7 promoter and AAV with the CT side under the Cre-dependent Syn promoter were generated, infected in the mouse cerebellum, and their cell-specific expression was confirmed. In the future, we plan to confirm the labeling PF-PC synapses and optimizing AAV-infection conditions, and then purify synaptic components of PF-PC synapses.
In addition, in order to perform labeling synapses between molecular layer interneurons (MLIs) and Purkinje cells in cerebellum, we have created an MLI-specific expression system using a tet-off system and specific promoters, and have establish an MLI-specific gene expression system. Currently, we are constructing an AAV that consist of the CT side of Split-TurboID into this MLIs specific AAV.
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