抗CD3抗体のscFv (OKT) からリンカーを介しα1サブユニットの細胞外領域(α1nAChRex)を接続したα1-OKTを恒常的に発現するRK13細胞を樹立した。得られたα1-OKTを、抗α1抗体mAb35を産生するハイブリドーマTIB-175、ヒトCD3を発現するJurkatを用いてフローサイトメトリーでの結合性の評価を行った。Jurkatとの結合は確認できたが、TIB-175との結合は確認できなかった。また、細胞傷害活性を確認できるほど十分な量のα1-OKTを得ることはできなかった。そこで、リンカー長の変更やα1nAChRex構造の変更等を行い、α1改変-OKTの作製を進めた。十数種類の変異体を作製し、タンパク質医薬品産生に多用されているCHO DG44細胞で安定的に産生されるα1改変-OKTの作製に成功した。現在、α1改変-OKTのTIB175への結合性について解析を進めている。
α1-OKTの有効性を最終的に評価するには、In vivoでのアッセイが必要である。重症筋無力症モデルラットは電気ウナギから精製したα1nAChRタンパクを免疫することで作製されていることから、本年度は、α1nAChタンパクの精製系の確立を行った。α1nAChのアンタゴニストであるα-ブンガロトキシンをCNBR-アガロースに架橋した担体を用いて、デンキウナギの電気器官からのα1nAChRのアフィニティー精製を行う系を確立した。現在、ラットへの免疫の準備を進めている。
重症筋無力症モデルラットでのα1-OKTの薬効評価ではOKTではなく、ラットに対するCD3抗体を用いる必要がある。抗ラットCD3作製にあたり、大腸菌からrat CD3タンパクを精製、マウスに免疫し、抗血清の産生まで確認している。引き続き、常法に従いモノクローナル抗体を樹立して行く予定である。
We established RK13 cells that constitutively express α1-OKT which linking the extracellular region of the nicotinic acetylcholine receptor α1 subunit (α1nAChR) with single chain Fv of the anti-human CD3 antibody (OKT) via a linker. The binding property of the obtained α1-OKT was evaluated by flow cytometry using the hybridoma TIB-175 that produces the anti-α1nAChR antibody mAb35 and Jurkat that expresses human CD3. The binding with Jurkat was confirmed, but the binding with TIB-175 could not be confirmed. In addition, it was not possible to obtain a sufficient amount of α1-OKT to confirm the cytotoxic activity. Therefore, we changed the linker length and the α1nAChR extracellular structure, and proceeded with the production of α1 modified-OKT. We prepared more than a dozen mutants and succeeded in producing α1 modified-OKT that is stably produced in CHO DG44 cells, which are widely used in protein drug production. We are currently analyzing the binding of α1 modified-OKT to TIB175.
An in vivo assay is required for the final assessment of the efficacy of α1-OKT. Since myasthenia gravis model rats are produced by immunizing the α1nAChR protein purified from electric eels, we established a purification system for the α1nACh protein this year. We have established a system for affinity purification of α1nAChR from the electrical organs of electric eels using a carrier in which α-bungarotoxin, which is an antagonist of α1nACh, is cross-linked to CNBR-agarose. Currently, we are preparing to immunize rats.
In the evaluation of the efficacy of α1-OKT in myasthenia gravis model rats, it is necessary to use CD3 antibody against rats instead of OKT. In the production of anti-rat CD3 antibody, rat CD3 protein was purified from Escherichia coli, immunized with mice, and the production of antiserum was confirmed. We will continue to establish monoclonal antibodies according to the conventional method.
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