初年度である今年はシェーグレン症候群を中心とする唾液腺の検体収集を行い、一部の解析を実施した。検体収取としては、具体的には、血清抗SSA抗体陽性シェーグレン症候群患者、血清抗セントロメア抗体陽性シェーグレン症候群患者、両抗体陽性患者、両抗体陰性非シェーグレン症候群患者の4群の唾液腺組織を数サンプルずつ収集し、遺伝子発現解析を行った。唾液腺上皮細胞のデータから、文献情報を基に各細胞種のマーカー遺伝子/タンパク質となりそうな特異的に発現するタンパク質をリストアップし、免疫染色で確認中である。今後はリンパ球の解析を進める。各細胞のTCR、BCRの解析を行い、major cloneの抗体をリコンビナントタンパク質として発現し、反応性の解析を行ない、それぞれの細胞が自己抗体産生細胞かどうかを検討する。自己反応性細胞と非自己産生細胞の間で発現解析を行う事で、病態の中心にあると思われる自己反応性リンパ球の特定と、治療標的の探索を行う。
検体収集にあたり、これまでシェーグレン症候群としてはあまり報告の無い種類の血清自己抗体を持つ患者由来の唾液腺検体を、偶然、複数入手できた。これまでの経験から、唾液腺組織内でそれらの自己抗体の産生が行われている事が想定されたた。その為、唾液腺に浸潤したB細胞をシングルセルソートしcDNAとし、そこから各細胞の持つ免疫グロブリン配列をPCRで増幅ののちシークエンスした。得られた配列を発現ベクターに挿入し、組織由来の抗体ライブラリを作製した。現在までに作製した100種類以上の抗体の反応性、特異性の解析を行なったところ、多くの自己抗体が含まれることを確認でき、現在は対応抗原の詳細な解析を実施している。同定した自己抗原について、当科で保存している多数の自己免疫疾患の血清をスクリーニングし、どのような病態と関連するのかを意味付けする。
This year, the first year of the project, salivary gland samples, mainly for Sjögren's syndrome, were collected and partially analyzed. To be specific, several samples of salivary gland tissue were collected from four groups of patients: serum anti-SSA antibody-positive Sjögren's syndrome patients, serum anti-centromere antibody-positive Sjögren's syndrome patients, both antibody-positive patients, and both antibody-negative non-Sjögren's syndrome patients, and gene expression analysis was performed. The data from salivary gland epithelial cells are being immunostained to identify specifically expressed proteins that may serve as markers for each cell type. We will now proceed with the analysis of lymphocytes. We will analyze the TCR and BCR of each cell, express major clone antibodies as recombinant proteins, analyze the reactivity, and examine whether each cell is an autoantibody-producing cell. By analyzing the expression between autoreactive and non-autoreactive cells, we will identify autoreactive lymphocytes that may be at the center of the disease and search for therapeutic targets.
In collecting the samples, we fortuitously obtained several salivary gland samples derived from patients with serum autoantibodies that are not commonly reported in Sjögren's syndrome. Based on our experience, we assumed that these autoantibodies might be produced in the salivary gland tissue. Therefore, B cells infiltrating in the salivary glands were single-cell sorted to obtain cDNA, from which the immunoglobulin sequences of each cell were amplified by PCR and sequenced. The obtained sequences were inserted into an expression vector to create a tissue-derived antibody library. The reactivity and specificity of more than 100 antibodies produced to date have been analyzed, and it was confirmed that many of them react with anti-nuclear antibody (ANA) test, indicating that these were autoantibodies. Further detailed analysis of the corresponding antigens is currently in progress. The identified autoantigens will be screened against sera of a number of autoimmune diseases stored in the department to make sense of what pathologies they are associated with.
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