本研究は、イトマキヒトデにおいて個体性が確立される変態過程において免疫系が担う役割を、幼生の炎症制御システムとの比較解析によって明らかにするものである。
まず、幼生におけるMIFを中心とした炎症制御システムを明らかにするために、酵母Two-Hybrid法によるMIF受容体の探索を計画していたが、残念ながら陽性クローンが一つも得られなかった。そこで方針を変え、架橋剤を用いてHisTag融合MIFと幼生の免疫細胞の膜タンパク質の架橋を試み、HisTagに対するアフィニティークロマトグラフィーによる受容体探索を行った。その結果、クラスB Gタンパク質共役受容体（GPCR）ファミリーに属するタンパク質が候補として得られた。このタンパク質の遺伝子配列をもとに、タンパク質の翻訳阻害剤であるモルフォリノアンチセンスオリゴを設計して受容体候補をノックダウンしたところ、2種のMIFのうち、免疫細胞に対する走化性因子として機能するApMIF2のノックダウンと同じ表現型が得られた。また、先行研究で取得済みの、2種のMIFで刺激した免疫細胞の時系列トランスクリプトームデータを用いて、MIFの下流シグナルを探索したところ、Rho GTPase、ERK、JNK、Notch等のシグナル経路が有意に活性化されている可能性が示唆された。
一方、変態過程の時系列トランスクリプトームデータから、変態の最初期で活性化される遺伝子群を抽出し、エンリッチメント解析を行った。その結果、GPCR ligand binding、MAPK signaling pathway等のGO termがエンリッチされた。さらに、得られたタンパク質-タンパク質間相互作用ネットワークにおいて、notch遺伝子がネットワークのハブとして機能していることが示唆された。
これらの結果から、幼生の炎症反応と変態初期過程の遺伝子発現は、ある程度似ていることが推測された。今後、両現象の相違について、いくつかの遺伝子の機能解析を行いながらさらに追求していく予定である。
The aim of this study is to clarify the role of the immune system in the metamorphosis process in which individuality is established in Patiria pectinifera by comparative analysis with the larval inflammation control system.
First, in order to clarify the MIFs-driven inflammatory response in larvae, we planned to search for the MIF receptors by the yeast Two-Hybrid system, but unfortunately no positive clones were obtained. Therefore, we attempted to crosslink HisTag recombinant MIFs and the membrane protein of larval immune cells using a cross-linking agent, and searched for the receptors by affinity chromatography on HisTag. As a result, proteins belonging to the class B G protein-coupled receptor (GPCR) family were obtained as candidate. Based on the gene sequence of this protein, we designed a morpholino antisense oligo, which is a protein translation inhibitor, and knocked down the receptor candidate. The knockdown phenotype was similar to that of ApMIF2, which functions as a chemotactic factor for immune cells. In addition, when the downstream signals of MIF were searched using the time-series transcriptome data of immune cells stimulated with two types of MIF acquired in the previous study, it was suggested that the signal pathways related to Rho GTPase, ERK, JNK, and Notch were significantly activated by the MIFs.
On the other hand, we extracted genes activated at the earliest stage of metamorphosis from the time-series transcriptome data of the metamorphosis process, and performed an enrichment analysis. As a result, GO terms such as GPCR ligand binding and MAPK signaling pathway were enriched. Furthermore, it was suggested that notch gene functions as a network hub in the obtained protein-protein interaction (PPI) network.
Taken together, it was inferred that the inflammatory response in larva and the gene expression in the early stage of metamorphosis are similar to some extent. In the future, we plan to further investigate the differences between the two phenomena while analyzing the functions of hub genes in the PPI network.