Cas13はRNAにガイドされてRNAを標的とするCRISPR-Casタンパク質である．標的RNA分解活性を失活したdCas13に，10 nm以内に隣接するタンパク質をビオチン標識するAPEX2を付加することで，標的RNA上に局在化するタンパク質を特異的にビオチン標識できると考えた．本研究では，CRISPR-Cas13システムとAPEX2を用いてRNA相互作用タンパク質を同定する手法の開発を目指した．標的として，マウスES細胞で発現するレトロトランスポゾンであるLong interspersed nucleotide factor- 1 (LINE-1 RNA)を選択した．先行研究によりLINE-1 RNAはマウスES細胞の核内において，転写制御因子として機能するKap1とNucleolinと結合することが報告されている．そこで，dCas13-APEX2システムによりLINE-1 RNAとKap1，Nucleolinとの相互作用が検出できるかどうか検証した．まず，Tet on システムで発現制御できるdCas13-APEX2をゲノムに組み込んだマウスES細胞の安定細胞株を作製した．次に，LINE-1 RNAを標的とするガイドRNAを設計し，発現プラスミドを作製した．dCas13-APEX2とガイドRNAを同時に発現し，APEX2によりビオチン標識されたタンパク質を細胞抽出液から濃縮した．しかし，Kap1とNucleolinが含まれるかどうかをウェスタンブロット法で検証した結果，これらの検出には至らなかった．この原因として，ガイドRNAの標的部位がdCas13の結合効率に影響する可能性が考えられる．今後，複数の標的部位を設計し，標的RNA特異的に結合するために最適な標的部位を探索する．
Cas13 proteins can cleave a targeted RNA through a short guide RNA with complementarity to the target sequence. I hypothesized that the catalytically dead Cas13 protein fused with APEX2, which labeled adjacent proteins within 10 nm with biotin, could specifically biotinylate proteins localized on the target RNA. In this study, I aimed to develop a method to identify RNA-interacting proteins using the CRISPR-Cas13 system and APEX2. Long interspersed nucleotide factor-1 (LINE-1 RNA), a retrotransposon expressed in mouse ES cells, was selected as a target. Previous studies have reported that LINE-1 RNA binds Kap1 and Nucleolin, which function as transcriptional regulators, in the nucleus of mouse ES cells. Therefore, I tested the ability of the dCas13-APEX2 system to detect interactions between LINE-1 RNA and Kap1 and Nucleolin. First, a stable cell line of mouse ES cells incorporating dCas13-APEX2 into the genome, which can be regulated by the Tet on system, was generated. Next, a guide RNA targeting LINE-1 RNA was designed and an expression plasmid was generated. dCas13-APEX2 and the guide RNA were expressed simultaneously, and proteins labeled with biotin by APEX2 were enriched from cell extracts. However, the presence of Kap1 and Nucleolin was failed to detect by western blotting. One possible reason for this is that the target site of the guide RNA affects the binding efficiency of dCas13. In the future, I will design multiple target sites and search for the best target sites for target RNA-specific binding.
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