我が国の医療費は年々増加し続けており、政府はより安価な製品の使用を推奨している。自己免疫疾患治療においても、現在高額な生物学的製剤が用いられているがより安価なバイオシミラー（BS）が市販されるようになってきた。しかし、BSは低分子化合物の後発医薬品とは性質が大きく異なり、不明な部分も多く、臨床ではバイオイクイバレンシーを評価して使用する必要がある。そこで、自己免疫疾患治療薬の抗体製剤の先発品とBSの血漿中濃度測定法の開発をLCMSMSにより検討した。
方法を簡単に示すと、抗体製剤としてインフリキシマブ（IFX）、IFX-BS、アダリムマブ（ADA）の標準製剤を人ブランク血漿35μLに添加後、蛋白消化酵素で断片化後、消化ペプチドをLCMSMSで分析した。内部標準蛋白も同様に消化後、消化ペプチドとして用いた。分析カラムには、ACQUITY UPLC BEH300 C18を用い、移動相は2種の溶離液をグラジュエント条件を設定し、流速0.2mL/minで溶出した。IFX、IFX-BS、ADAの血漿中濃度は、0.35、3.5、35、350μg/mLの4濃度で検討した。MRMにはIFX（IFX-BS）469.60>603.80、ADA　535.30>901.45、内部標準ペプチド　612.30>978.55を用いた。相対保持時間は、IFX(IFX-BS)　5.69分、ADA　6.08分、内部標準ペプチド　4.53分であり、4化合物とも分離は良好であり、7分以内に溶出した。
IFX、IFX-BS、ADAの検量線はいずれ良好な直線性が示された。またIFX-BSは先発品のIFXと同様の方法で測定できることが確認された。
今回、LCMSMSを用いて、自己免疫疾患治療に使用される抗体製剤のIFXの先発品とBS、ADAの人血漿中濃度測定法を確立した。本測定法は産生した自己抗体との交差反応による測定妨害を避けることができるため、抗体製剤の血中濃度を正確に定量できる。本測定法は、BS製剤開発でのバイオイクイバレンシーの評価や臨床において、抗体製剤のスイッチ療法における治療効果や副作用のモニタリングに有用である。
Medical expenditure in Japan is increasing annually, the Japanese government recommends the use of less expensive preparations. In the treatment of autoimmune diseases, expensive biologics are presently used, but less costly biosimilar (BS) products are available on the market. However, the properties of BS preparations differ greatly from low-molecular-weight compound generic drugs, and there are many unknowns. Therefore, it is necessary to evaluate their bioequivalence in clinical practice. We developed a quantitative method for determining the human plasma concentration of antibodies and BS preparations used for the treatment of autoimmune diseases (infliximab ([IFX], IFX-BS, and adalimumab [ADA]) using LCMSMS.
Briefly, a standard preparation of IFX, IFX-BS, or ADA was added to human blank plasma (35 µL) and fragmented with protein digestive enzymes, and then digested peptides were analyzed in LCMSMS. The internal standard protein was similarly digested and used as an internal standard peptide. ACQUITY UPLC BEH300 C18 was used as an analytical column, and the mobile phase was eluted at a flow rate of 0.2 mL/min using two eluents under gradient conditions. The plasma concentrations of IFX, IFX-BS, and ADA were examined at the four concentrations of 0.35, 3.5, 35, and 350 µg/mL. For MRM, IFX and/or IFX-BS 469.60> 603.80, ADA 535.30> 901.45, and internal standard peptide 612.30> 978.55 were used. The relative retention times were: IFX and/or IFX-BS, 5.69 min; ADA, 6.08 min; and internal standard peptide, 4.53 min. All four compounds thus eluted within 7 min.
Calibration curves were good, and linearity was shown for IFX, IFX-BS, and ADA. In addition, it was confirmed that IFX-BS can be measured using the same method as for the original IFX preparation.
In this study, LCMSMS was used to establish a qualitative method for determining the human plasma concentrations of IFX, the original antibody preparation, and BS preparation and ADA used in the treatment of autoimmune diseases. This LCMSMS method can avoid measurement interference due to cross-reaction with the autoantibody produced and thus can accurately quantify the plasma concentrations of antibody preparations. This assay is useful for the evaluation of bioequivalence in the development of BS preparations and in monitoring the therapeutic effects and side effects of switch therapy of antibody preparations in clinical practice.