本申請研究の事業計画の2年目の目標である「CPG 予定細胞をマニピュレーションにより単離し、RNAseq によりCPG 細胞特異的遺伝子発現プロファイルを得る。」をほぼ達成した。
尾芽胚初期から尾芽胚後期までにおいて5対の運動神経細胞のうちA10.64細胞のみが70秒間隔のCa2+振動を示すこと、このCa2+振動は尾部の筋肉Ca2+と同期するようになること（ホヤ国際学会）から、尾芽胚期においてA10.64細胞がCa2+振動することが遊泳運動を引き起こす引き金となると考えられた。しかし、本Ca2+振動の分子機構は全く未知である。そのため、予備実験ではターゲットを絞ったアプローチではなく、1細胞由来の転写物を網羅的に同定可能な、single-cellRNAseq解析を試みた。そのためには、ホヤ尾芽胚を構成する約1600個の細胞の中からCa2+振動を示す細胞を単離する必要があるが、初期尾芽胚ではCa2+の濃度上昇がみられるのはこのCa2+振動細胞のみである（Akahoshi et al., 2017）。そこで、申請者はGCaMP6 mRNAを導入した初期尾芽胚を酵素処理により細胞ごとにバラバラにし、Ca2+動態を計測しながら、Ca2+振動する細胞を探索した。その結果、数十秒周期でCa2+振動しつづける細胞を単離することに成功した。このことは、ホヤCa2＋振動細胞は細胞間の相互作用なしに細胞自律的にCa2＋振動可能であることを意味する（動物学会、分子生物学会）。
単離したCa2+振動細胞に由来する遺伝子発現情報をilluminaNovaSeqにより1細胞あたり約6000万リード得た（N=5、およびCa2+振動しないコントロール細胞N=2の計７細胞分）。群間比較解析によりCa2+振動細胞とネガコン細胞間で有意な差がみられた遺伝子のリストを得た。差異発現Top10にはCa2+振動を担うと考えられる膜電位依存性チャネルや小胞体輸送タンパク質等を含む候補遺伝子が含まれていた。これらの候補遺伝子が実際にCa2+振動を担うか確かめるため、ノックダウン実験準備を進めている。
The second year goal of the project plan of this application research is to "Isolate CPG-scheduled cells by manipulation and obtain CPG cell-specific gene expression profile by RNAseq.". This goal was successfully almost achieved.
Only the cell lineage A10.64 cells out of the five pairs of motor neurons show Ca2 + oscillations at 70-second intervals from the early stage of the tailbud embryo to the late stage of the tailbud embryo. Therefore, it was suggested that Ca2 + oscillations of A10.64 cells in the tailbud embryo stage would trigger swimming movement. However, the molecular mechanism of how this cell exert Ca2 + oscillation is completely unknown. For this reason, in preliminary experiments, single-cell RNAseq analysis was attempted, which is not a targeted approach but can comprehensively identify transcripts derived from one cell. For that purpose, it is necessary to isolate Ca2 + oscillation cells from about 1600 cells constituting the tailbud embry (Akahoshi et al., 2017). Accordingly, the applicant searched the cells that vibrated Ca2 + while measuring the Ca2 + dynamics while separating the initial tailbud embryos into which the GCaMP6 mRNA had been injected by enzymatic treatment. As a result, we succeeded in isolating cells that continued to oscillate Ca2 + in tens of seconds. This means that ascidian Ca2 + -oscillating cells are capable of cell-autonomously Ca2 + -oscillating without cell-cell interaction (Animal Society 2019). About 60 million reads per gene of gene expression information derived from the isolated Ca 2+ oscillatory cells were obtained using illuminaNovaSeq (N = 5 cells and Ca 2+ non-oscillating  control cells N = 2, 7 cells in total). A list of genes showing significant differences between Ca2 + oscillatory cells and negative control cells. The differentially expressed Top10 contained candidate genes including membrane voltage-gated channels and ER transport proteins that are thought to be responsible for Ca2 + oscillation. Preparations for knockdown experiments are underway to confirm that these candidate genes are actually responsible for the Ca2 + oscillation.