酸化還元酵素はバイオ電池やバイオセンサーなど多くのアプリケーションで使用されているが、実際の応用は、活性や安定性の低さから比較的限定されていた。酵素を改良する手段として、当研究室では、進化工学によりNAD(P)依存性酸化還元酵素をスクリーニングするためのµTASの開発が進められてきた。我々のµTASは３つのマイクロ流体デバイスからなる。まず、「区画化用デバイス」により、NAD(P)依存性酸化還元酵素とその遺伝子を固定したビーズを１個ずつ含むように区画化した酵素反応液を作成し、各区画内で独立に酵素反応を行う。次に、「検出用デバイス」により、ビーズ上の酵素活性により生じた各区画ごとのNAD(P)Hの酸化電流値を導電性ダイヤモンド電極により測定する。最後に、誘電泳動を利用した「選別用デバイス」により、活性が高い酵素を固定しているビーズを含む液滴を選別・回収する。これまでに、3つのマイクロ流体デバイスを組み合わせて、Error-prone PCRによって構築したIDHのランダム変異体ライブラリーのスクリーニングを2ラウンド行った。その結果、選別した変異体ライブラリーでは集団としての酵素活性が回復したことから、我々のµTASによって活性を有する変異体酵素遺伝子をライブラリーから選別できることが示唆された。
今回は、初期および2ラウンド後のライブラリーからそれぞれ無作為に取得した7つの変異体クローンの比活性をNADHの吸光度より測定した結果、初期ライブラリー由来のクローンはすべて酵素活性が低かったのに対して、2ラウンド後のライブラリー由来のクローンの半数以上は活性を保持していた。その中でも比活性が最も高かった変異体K17Rについて大腸菌で大量発現・精製し、Kineticパラメータと熱安定性を測定した結果、野生型IDHと比べて熱安定性が低下することなく、kcat/Kmが2倍以上向上していた。K17R変異体の変異部位は活性部位・NAD結合部位から離れたところに位置しており、ランダム変異によって予期せぬ部位の変異によるわずかな構造の変化が酵素活性に影響を与えることが示唆された。以上の結果から、本スクリーニング系がNAD(P)H依存性酸化還元酵素の定向進化に適用できることが示された。
Although oxidoreductases are used for many applications such as biofuel cells and biosensors, the actual application of NAD(P)-dependent oxidoreductases is relatively limited probably due to their low activity and stability. As means for improving the enzymes, we focused on an evolutionary engineering approach through the development of µTAS for high-throughput screening of NAD(P)-dependent oxidoreductases. Our µTAS are composed by three microfluidic devices. First, both protein and gene for NAD(P)-dependent oxidoreductase are immobilized on microbeads which is compartmentalized in droplets by 'encapsulating device'. Second, the quantity of NAD(P)H produced by the enzyme reaction in each droplet is detected by 'NAD(P)H-measuring device' with boron-doped diamond electrodes. Third, droplets containing microbeads with highly active enzymes are screened by 'dielectrophoretic sorting device'. In the previous study, we combined the three microfluidic devices and performed screening of a randomly-mutated isocitrate dehydrogenase (IDH) library constructed by error-prone PCR. After two rounds of screening, the activity of the resulted enzyme library was recovered to the wild-type level, suggesting that active enzyme genes in the library were successfully enriched by our µTAS.
In the present study, we randomly picked up seven mutant clones from each of the initial library and the library after 2 rounds of screening, respectively, and measured their specific activity based on the absorbance of NADH. As a result, the activities of all clones from the initial library were relatively low, while more than half of clones from the 2nd library retained the enzymatic activity. Among these 2nd-library clones, a mutant K17R with the highest activity was expressed in E. coli and purified. Then we measured kinetic parameters and thermal stability of the K17R mutant. As a result, kcat/Km of the mutant enzyme was higher than that of the wild-type IDH by more than 2-fold, while Tm was retained. The mutation site of the K17R mutant was located far from the active site and the NAD binding site, suggesting that a slight structural change due to a single mutation of the unexpected site affected the enzyme activity. These results indicate that our screening system can be applied to directed evolution of NAD(P)-dependent oxidoreductases.