私達は有性生殖を行うクマムシParamacrobiotus sp. TYO系統の交尾行動を初めて記載し、オスはメスに対して、首を振りながら追いかけ射精に至ることを示している。さらに1匹のメスに何匹ものオスが群がる様子も確認されることから、オスを誘引または興奮させるフェロモンの存在が示唆されている。本研究では、クマムシのオス誘引フェロモンの単離と同定を目指した。
雌雄共存時のオスの行動観察から、フェロモンの活性を誘引活性と興奮活性の2つを想定した。メス飼育液中にオス誘引活性があるかを確認するために、メス10匹を一晩飼育して得たメス飼育液を用いて寒天小片を作成し、これに対するオスの行動を観察した。オス飼育液を用いて作製した寒天小片の誘引率は20%以下だったのに対し、メス飼育液を用いて作製した寒天小片の誘引率は70%であった。よって、メス飼育液にはオスを誘引するフェロモン物質が存在することが示された。さらにメス飼育液にオス興奮活性があるかを確認するために、個体追跡ソフトUMA-Trackerなどを用いて歩行速度、首振り回数などを計測した。メス飼育液中でのオスの歩行速度は、オス飼育液中での歩行速度に比べて有意に速かった。さらに、オス飼育液中ではほとんど首を振らずに歩くのに対して、メス飼育液ではしきりに方向転換する様子が観察され、首振りの回数も上昇した。これらのことから、歩行速度を速め、首振りを誘発するオス特異的な興奮フェロモンの存在が示された。
両者の活性成分を分画するために、メス飼育液をSep-Pakにより溶出した画分の誘引活性と興奮活性を測定した。オス誘引率は、素通り画分と20%メタノール抽出液で強い誘引活性が見られ、一方、個体追跡による興奮活性は、80%メタノール抽出液に強い活性が見られた。以上の結果から、両者は異なる化合物に由来することが明らかになった。
Previously it was reported the mating behavior of tardigrade Paramacrobiotus sp. TYO strain, and showed that males chased females while shaking their heads until ejaculation. In addition, we observed that several males approached to single female, suggested secretion of male-attracting pheromones from the female. Therefore, we aimed to isolate and identify the pheromones of the tardigrades.
Ten TYO females were reared overnight to obtain female culture water. Using agar pieces containing the culture water, attractive rates of males were measured. To confirm character of the female culture water, the solution was eluted by H2O, 20%,40%,60%, and 80% methanol with Sep-Pak® C18. Then by using agar pieces containing the eluted fractions, the male attractive rates were measured. The rate of attracted males to agar pieces without female culture water was less than 20%, whereas 70% of males were attracted to agar pieces containing the female culture water. Therefore, existing of the male-attracting pheromone in the female culture water was indicated. Then, by using the agar piece containing the fractions eluted by Sep-Pak® C18, strong attracting activities were observed in the pass-through fraction and the 20% methanol extract. Thus, the male-attracting pheromone should be a substance with high polarity.
Next, walking speed of the males were measured, and number of head-swings were counted with a tracking software UMA-Tracker. By tracking analyses, the male walking speed in the female culture water was significantly faster than normal water, moreover, the males shook their head widely and frequently. These results suggested that a presence of male-exciting pheromone that induces the head-shaking. And by individual tracking analyses with the Sep-Pak® C18 eluted fractions, the strong exciting activities were observed in the 80% methanol extracts. Therefore, it is considered that a male-exciting pheromone was a highly hydrophobic molecule.
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