各細胞株のTTCを作成した。MTT assay法により薬剤指摘濃度を確認した後に樹立したTTCを用いてソラフェニブを添加した。その結果HepG2については約10種類, PLC/PRF/5については約20種類のコロニーがピックアップされた。ゲノムDNAを抽出しソラフェニブ耐性遺伝子の候補遺伝子を同定することが可能であった。DNAを抽出し, トランスポゾンにより挿入された箇所を制限酵素処理にて切り出しDNAを増幅させ, その塩基配列を同定し, 遺伝子を同定した。複数の耐性コロニーに共通して出現している遺伝子が幾つか同定され, これが投与薬剤に対する耐性遺伝子候補としてピックアップされた。
We used a novel method involving transposons to screen and identify drug-resistant genes. Transposons are DNA sequences that move from one location on the gene to another. A modified piggyBac transposon was designed as an insertion mutagen, and a cytomegalovirus (CMV) promoter sequence was added to induce strong transcription. When the transposon is inserted to the upstream of a certain gene, the gene will be overexpressed while when intserted down or intragenically, it will be downregulated. After establishing a transposon-tagged cell library, we treated cell lines derived from Hepatocellular carcinoma. We performed splinkerette PCR and TOPO cloning on the resistant colonies. Bacterial colonies were sequenced, and next-generation sequencing was used to identify the overexpressed/downregulated sequences as candidate genes for Sorafenib resistance. We identified several candidate genes from 30 resistant colonies.

研究種目 : 基盤研究(C)(一般)
研究期間 : 2014～2016
課題番号 : 26461019
研究分野 : 消化器外科