以前, 申請者らは尋常性天疱瘡患者の末梢血リンパ球を組み換えDsg3(rDsg3-Etag)と反応させ, フローサイトメトリーを用いてIgG産生性Dsg3特異的B細胞を単離し, そのVH遺伝子と塩基配列の解析を行った。その予備結果を応用して, 本年度はこれまでよりも精度と効率を高めたDsg特異的B細胞の単離方法として, 天疱瘡患者の末梢血リンパ球で7-AAD陰性およびCD19陽性となるB細胞の中から, E-tagおよびHis-tag陽性細胞をDsg特異的B細胞として検出できるシステムを確立できた。この方法を検証するため, Dsg3に対するモノクローナル抗体のノックインマウスの末梢血リンパ球を用いてDsg3特異的B細胞の単離を試みた。単離された細胞からmRNAを抽出し, RT-PCR法でIgGの重鎖および軽鎖の増幅が確認された。得られた重鎖および軽鎖の塩基配列を検討したところ, ノックインされたDsg3に反応するモノクローナル抗体と一致していたことから, この方法を用いて末梢血中からDsg3特異的B細胞を単離できる実現性が十分に高いことが示された。
実際に落葉状天疱瘡患者の末梢血とDsg1組み換え蛋白を反応させた実験では, この方法で分離された単一細胞から, RT-PCR法でIgGの重鎖(IgH)および軽鎖(Igκまたはλ)にあたるcDNAの増幅が確認できた。得られたIgG領域の塩基配列を導入したHEK細胞は, フローサイトメトリーでDsg1との反応性が確認できた。さらに, このHEK細胞から作成された分泌型のモノクローナル抗体は, ELISAでDsg1特異的な反応性を示し, 正常ヒト皮膚を基質とした蛍光抗体間接法で, 患者血清と同様に細胞表面へのIgGの沈着を示した。
単一細胞の分離・解析法が確立して複数症例に拡大できれば, 疾患単位でのDsg特異的B細胞レパトアを樹立することが可能となり, 将来的には自己抗体の病原性や病勢(活動期と寛解期との比較など)と関連づけた研究も計画していきたいと考えている。
As a research progress of this year, we were able to establish a system that can detect Dsg-specific B cells as E-tag and His-tag positive cells from the peripheral blood of pemphigus patients. In order to verify this method, we tried to isolate Dsg3-specific B cells from the peripheral blood lymphocytes of knock-in mouse of monoclonal antibody against Dsg3. Messenger RNA was extracted from the isolated cells as a single cell, and the amplification of IgG heavy chain and light chain was confirmed by RT-PCR method. The nucleotide sequences of the obtained heavy and light chains were examined and found to be consistent with the sequences of knocked-in monoclonal antibody reacting with Dsg3. Therefore the feasibility of this method to isolate Dsg3-specific B cells from the peripheral blood was demonstrated.
In an experiment in which the peripheral blood of a patient with pemphigus foliaceus was reacted with recombinant Dsg1 protein, the IgG heavy chain (IgH) and light chain (Igκ or λ) amplification of cDNA was confirmed from isolated cells as a single cell. The HEK cells, into which the nucleotide sequence of the obtained IgG region had been introduced, were able to bind to Dsg1 in flow cytometric analysis. Furthermore, the secreted monoclonal antibody produced by these HEK cells exhibits Dsg1-specific reactivity by ELISA, and IgG deposition on the cell surface of epidermal cells by indirect immunofluorescence using normal human skin as a substrate just like the serum from pemphigus patients.
If single cell isolation and analysis methods can be established, it becomes possible to establish Dsg-specific B cell repertoire and elucidate pathophysiology of autoantibodies in pemphigus in the future.