今年度は、放線菌が生産する熱ショック代謝物 (HSM) として見出したアゾキシ天然物、Dihydromaniwamycin E (DME) のがん幹細胞 (Cancer Stem Cells: CSC) に対する抑制活性の作用機序解析を試みてきた。はじめに、分子プロファイリング支援活動の細胞パネル解析により、DMEの標的タンパク質の候補が複数予測された。そこで、これらの阻害剤のCSCに対する抑制活性を評価したが、DME同様の活性を見出すには至らなかった。続いて、アゾキシ構造を有するDMEの類縁物質が、NF-kBシグナルを阻害することに着目した。本阻害剤についても同様に活性評価を試みたところ、CSCに対する抑制活性を示すことがわかった。そこで、DMEのNF-kBシグナルに与える影響を評価したところ、阻害効果は見られなかった。この原因としては、NF-kBシグナル阻害剤のオフターゲットがCSCの抑制活性において重要である可能性があると考えている。ここまでの解析では、DMEの作用標的を見出すことができなかったため、DMEの標的タンパク質を直接的に同定することを目指すこととした。はじめに、DMEを磁気ビーズへと固定化し、プルダウンアッセイにより解析することとした。構造活性相関解析により、DMEが有する唯一の水酸基が活性に重要でないことが判明していたため、水酸基部分をビーズへと固定化した。尚、固定化後の上清をHPLCにより解析し、DMEがほとんど検出されないことを確認している。続いて、作製した磁気ビーズを使用した種々の条件検討を通じて、DMEに結合することが予想される複数のタンパク質バンドを検出することに成功した。そこで、これらタンパク質バンドを切り出し、LC-MS/MSによる解析を依頼したが、タンパク質濃度の問題で同定するには至らなかった。
This year, we have attempted to analyze the mechanism of action of an azoxy natural product, dihydromaniwamycin E (DME), found as a heat shock metabolite (HSM) produced by actinomycetes, in its inhibitory activity against cancer stem cells (CSCs). First, cell panel analysis by “Support for molecular profiling” predicted several candidate target proteins of DME. We then evaluated the inhibitory activity of these inhibitors against CSCs, but failed to find DME-like activity. Next, we focused on an analog of DME with an azoxy structure that inhibits NF-kB signaling. We attempted to evaluate the activity of this inhibitor in the same way and found that it showed inhibitory activity against CSCs. We then evaluated the effect of DME on NF-kB signaling and found no inhibitory effect. We speculate that this is due to the off-target of this NF-kB signaling inhibitor, which may be important in the inhibitory activity of CSCs. Since we could not find the target of DME in our analysis so far, we decided to aim to directly identify the target protein of DME. First, DME was immobilized on magnetic beads and analyzed by a pull-down assay. Since the structure-activity relationship analysis showed that the only hydroxyl group of DME was not important for the activity, the hydroxyl group was immobilized on the beads. The supernatant after immobilization was analyzed by HPLC, and it was confirmed that almost no DME was detected. Then, through examination of various conditions using the magnetic beads, we succeeded in detecting several protein bands that were expected to bind to DME. We then cut out these protein bands and requested LC-MS/MS analysis, but were unable to identify them due to protein concentration issues.
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