生体内において、タンパク質の機能は遺伝子の発現レベルや細胞小器官への局在などによって巧みに制御されている。したがって、タンパク質の機能を人工的に制御することができれば、疾患を含めたさまざまな生命現象の解明や治療方法の研究に役立つはずである。しかし、酵素や抗体などの任意のタンパク質の機能を一元的に制御可能な技術はこれまでに確立されていない。そこで本研究では、人工改変した非ウイルス性のタンパク質シェルを用いて、外部刺激応答性の新規タンパク質機能制御システムを開発することを目的とした。そのために、まずは多くの細菌が有するBMC（bacterial microcompartment）と呼ばれる巨大なタンパク質シェル複合体に着目し、任意の標的タンパク質を内包可能な多様な人工タンパク質シェル群の創出を試みた。具体的には、BMCシェル形成タンパク質として知られるEutSとPduUに負電荷のアミノ酸変異を導入し、error prone PCR (epPCR) を用いてランダムな変異を導入したライブラリを構築したのち、正電タグを付与した毒性タンパク質を大腸菌内で共発現させ、生育した大腸菌を選別した。このようにして、毒性低減に働くよう進化したPduU変異体を精製したところ、直径約30、50、70 nmのシェル構造を形成することが明らかとなった。また、encapsulinと呼ばれる細菌由来のタンパク質シェルのループ構造に、HiBit (11 aa), Spytag (13 aa), FP11(16 aa)と呼ばれる３種類のsplit proteinsの部分構造（ペプチド断片）を導入したシェルタンパク質を設計した。さらに、これらencapsulin改変体を大腸菌内で発現し、ゲル濾過クロマトグラフィー（SEC）で精製することによって、シェルの形成を確かめた。また、split proteinsの部分構造と相互作用するメイン構造（外部刺激因子）を別に調製しておき、溶液中で混合することによって、split proteinsの相互作用と、それに伴うシェルの崩壊をSECおよび動的光散乱によって検討した。
In living organisms, protein functions are intricately regulated by several factors such as gene expression levels and cellular organelle localization. While artificial control of protein functions holds promise for elucidating biological phenomena and disease mechanisms, a unified technology capable of controlling the function of arbitrary proteins, such as enzymes or antibodies, has not yet been established. Thus, this study aimed to develop a novel protein function control system responsive to external stimuli using artificially modified non-viral protein shells. To achieve this goal, we first decided to create a diverse group of artificial protein shells capable of encapsulating target proteins by utilizing bacterial microcompartment (BMC) shell-forming proteins. We introduced negatively charged amino acid mutations into BMC shell-forming proteins, EutS and PduU, and constructed libraries with random mutations using error-prone PCR (epPCR). Subsequently, we co-expressed toxic proteins tagged with positive charges in Escherichia coli and screened for bacterial growth. Through this process, we identified PduU mutants that had evolved to reduce toxicity by forming shells with diameters of approximately 30, 50, and 70 nm around the toxic proteins. Additionally, we introduced peptide fragments of three split proteins, HiBit (11 aa), Spytag (13 aa), and FP11 (16 aa), into loop structures of an encapsulin, which is a bacterial-derived protein shell. We expressed these modified encapsulins in E. coli and confirmed shell formation by size-exclusion chromatography (SEC). Moreover, we separately prepared the remaining structures of the split proteins (external stimuli factors) and examined their interactions with the peptide fragments in the modified encapsulins. We are currently investigating whether these interactions can induce shell collapse, using SEC and dynamic light scattering.
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