生体物質や細胞を液滴に入れて音響浮揚させることにより、固相の反応容器との接触がない非接触界面を有する新規な反応場として、高効率反応プロセスを創成する研究を行なっている。以前の研究において、接着性細胞であるHuh-7細胞に効率良く遺伝子導入が可能であることを明らかにしていたことから、接着細胞と比較して遺伝子導入効率の低い浮遊細胞への導入を試みた。遺伝子導入試薬であるリポフェクトアミンとプラスミドの複合体を形成し、３種の浮遊細胞への遺伝子導入を行なった。その結果、神経系PC12細胞において、既存の試験管内と比較し、ルシフェラーゼおよび緑色蛍光タンパク質の数倍高い遺伝子発現が観察された。エンドサイトーシス阻害剤処理を行ったところ、プラスミドは複数の経路で遺伝子が導入されていることが明らかになった。さらにトリパンブルーを用いた細胞を染色したところ、音響浮揚によって細胞膜の撹乱が誘導され、高効率な遺伝子導入に寄与している可能性が示された。さらに、病原性タンパク質を浮揚液滴内でファージ提示法による親和性選択を行った。微粒子にタンパク質を固定化し、ランダムなペプチドライブラリーを含むファージと相互作用させ、結合しているファージを回収した。また同時に、同じタンパク質を固定化した微粒子を用いて、試験管内で操作を行い、音響浮揚環境の効果を明らかにすることとした。その結果、試験管内で行った操作では、標的とするタンパク質に結合するファージプールが得られたものの、化学合成したペプチドは結合活性を示さなかった。一方で、浮揚液滴内で同じ操作をして得られたファージから同定されたペプチドは、標的タンパク質に結合活性を示した。これらの成果は、音響浮揚が既存の試験管と比較して、優れた成果を示すバイオ反応環境であることを示唆する。
We have been developing a non-contact bioreactor using levitation technology, instead of a conventional reaction vessel with solid-phase. Previous research revealed that it was possible to efficient transfection of plasmid into Huh-7 cells that is one of adherent cells. In this study, we attempted to introduce genes into floating cells using levitation. This is because floating cells are known to have lower gene transfer efficiency than adherent cells. A target gene-containing plasmid was mixed with lipofectamine as a gene delivery reagent to form a complex and the complex was introduced into three floating cells. The gene expression of luciferase and green fluorescent protein was observed in nervous PC12 cells, the expression efficiency in levitated droplet was greater than that in conventional tube. In addition, treatment with an endocytosis inhibitor revealed that the plasmid were introduced into cells through multiple routes. Furthermore, affinity selection against pathogenic proteins using phage display method in floating droplets eas performed. Phages containing a random peptide library were interacted with proteins immobilized on microparticles in levitated droplet, and bound phages were recovered. Peptides identified from phages in floating droplets showed binding activity to the target protein. These results suggest that acoustic levitation has a potential to be a novel bioreaction environment that exhibits superior results compared to conventional test tubes.

申請種類 : 福澤基金研究補助