JA1の転写調節領域に見られるCpGアイランドの進化的解析を行なった結果、CpGの増加は霊長類が分岐する以前に遡ることがわかった。この結果は新世界ザルのマーモセットにおいても、マウスに比してJA1の発現領域が拡大している観察事実と一致する。次に、ヒトiPS細胞のJA1当該配列をマウス型に置き換えるための実験を行なった。CpGアイランド内において、仮想的な共通祖先からのCpG配列の進化的変化を予測したところ、イントロン１の前半部は霊長類で獲得、後半部ではマウスで消失が集中して生じていた。そこでこのイントロン１をマウスの配列に置き換えることを目指した。マウスのイントロン1（約450塩基対）と、その両端に約250bpのヒト配列と相同なホモロジーアームからなる１本鎖DNAを精製し、ヒトのイントロン１の両端をターゲットとするcrRNAおよびCas9タンパク質と混合してiPS細胞に導入、単一細胞に由来するクローンをマトリゲル上で単離し、PCRにより目的の配列にゲノム編集されたクローンを探索した。このような長鎖DNA置換は効率が悪く、これまでのところ目的のクローンは得られていないが、さらに探索を進める。イントロン１内にはヒト進化過程で獲得された転写因子Xの結合モチーフがあり、ヒトiPS細胞由来神経幹細胞におけるノックダウンによりJA1の遺伝子発現が低下する予備的結果を得ているが、同時にiPS細胞自体の増殖が低下し、安定なデータが得られない難点があった。そこでiPS細胞の段階で遺伝子導入し、神経幹細胞に分化誘導した後にノックダウンができるベクター開発を行なった。増殖過程で安定的に細胞内に維持されるよう、ゲノムに組み込まれるトランスポゾンベクターを用い、そこにタモキシフェン誘導型Creと、Cre依存的に標的RNAに対するmiRNAの発現が開始されるカセットを同時に持たせたベクターを作成した。転写因子Xを標的とするベクターは完成しており、JA1遺伝子発現への影響を解析する準備が整った。
Evolutionary analysis of CpG islands in the JA1 transcriptional regulatory region showed that the increase in CpGs dates back to before primate divergence and is strongly conserved within primates. This result is consistent with the observation that the expression region of JA1 is expanded in New World monkey marmosets compared to mice. Next, we performed experiments to replace the relevant JA1 sequence in human iPS cells with the mouse counterpart, and found that the first half of intron 1 was acquired in primates, while the second half was lost in mice, indicating that the evolutionary changes in CpG sequences from a hypothetical common ancestor within the CpG island were concentrated in the first half of intron 1. Therefore, we aimed to replace this intron 1 with a mouse sequence. Single-stranded DNA consisting of mouse intron 1 (about 450 base pairs) and homology arms homologous to the human sequence of about 250 bp at both ends was purified, mixed with crRNA targeting both ends of the human intron 1 and Cas9 protein, and introduced into iPS cells. Clones derived from single cells were isolated on Matrigel, and PCR was performed to search for clones whose genome had been edited to the desired sequence. Such long-strand DNA substitutions are inefficient, and so far no clones with desired sequences have been obtained, but further exploration will be conducted. There is a binding motif for transcription factor X in intron 1, which was acquired during human evolution. We have obtained preliminary results that knockdown of JA1 in human iPS cell-derived neural stem cells results in decreased gene expression of JA1, but at the same time the proliferation of iPS cells themselves was decreased, making it difficult to obtain stable data. Therefore, we developed a vector that allows gene transfer at the iPS cell stage and knockdown after induction of differentiation into neural stem cells. In order to maintain the vector stably in the cell during the proliferation process, a transposon vector that is integrated into the genome was used, and a vector that simultaneously contains tamoxifen-induced Cre and a cassette that initiates miRNA expression for the target RNA in a Cre-dependent manner was created. The vector targeting transcription factor X is complete and ready for analysis of its effect on JA1 gene expression.