本年度は，ファイバ状hiPS由来心筋組織の収縮力計測法を用いた薬剤応答の評価確立、および成熟化の指標としての拍動伝播速度計測、の2つの研究を実施した．

(1) ファイバ状hiPS由来心筋組織の収縮力計測法を用いた薬剤応答の評価
本年度は，昨年度に確立した成熟化ファイバ状hiPS由来心筋組織に対し、陽性および陰性の変力作用を有するIsoprotenolおよびPropranololを暴露し、応答の確認を行った。暴露後に位相差顕微鏡で動画（25 fps）を撮影し、画像処理により心筋組織上の特徴点の自動抽出をすることで、ファイバ状組織の曲がり角度の時間変化を得た。ファイバ状組織の曲がり角度は有限要素法解析による数値計算より、組織の収縮力に変換した。Isoprotenolの暴露により心筋組織の収縮力は上昇し、また逆にPropranololの暴露により、収縮力は下降した。これにより、提案したファイバ状心筋組織の収縮力の計測を実現した。興味深いことに、ファイバ状hiPS由来心筋組織は細く（直径100 µm程度）、わずか0.1 nMのIsoprotenolの暴露に対しても収縮力の上昇が認められた。これは既存の心筋組織の収縮力計測の方法（マイクロピラー法）に比べ、100倍程度の感度であり、本手法の有用性が示された。

(2) 成熟化の指標としての拍動伝播速度計測
形成したファイバ状心筋組織を培養しながら、成熟化指標を評価するために、蛍光ライブイメージングによる収縮伝播速度の計測手法を確立した。hiPSC由来心筋細胞にカルシウム応答緑色蛍光蛋白であるGCaMPを恒常的に発現させ、カルシウムイオンの細胞内濃度を可視化した。心筋細胞の収縮は細胞内カルシウムイオンの流入に同期するため、蛍光シグナルの伝搬速度として収縮伝搬速度を評価した。結果、心筋の成熟が進むにつれて、伝搬速度が上昇することが確認された。以上より、組織を固定などの処理することなく生かした状態で、成熟度を評価することに成功した。
This year, we conducted two studies: (1) establishment of evaluation of drug response of fiber-like hiPS-derived cardiac tissue using contractile force measurement and (2) measurement of contractile propagation velocity as an indicator of maturation.

(1) Evaluation of drug response using contractility measurement of fiber-like hiPS-derived cardiac tissue
This year, we exposed Isoprotenol and Propranolol, which have positive and negative inotropic activities, to matured fiber-like hiPS-derived myocardial tissue established in the previous year to confirm the drug response. After exposure, movies (25 fps) of the contracting fiber-like cardiac tissues were captured by phase contrast microscopy. Through computational image processing, the temporal changes in the bending degree of the fiber-like tissue were obtained. The bending angle of the fiber-like tissue was converted into tissue contractility by finite element analysis. As a result, the contractility of the cardiac tissue increased with exposure to Isoprotenol and decreased with exposure to Propranolol. This result shows that our proposed system enabled to measure the contractility of fiber-shaped cardiac tissues. Interestingly, since the fiber-like hiPS-derived cardiac tissue was thin (~100 µm in diameter), the increase in contractile force after exposure to only 0.1 nM of Isoprotenol was observed. This result indicates that our method is about 100 times more sensitive than the existing method of measuring contractility of myocardial tissue (for example, the micropillar method), indicating the usefulness of this method.

(2) Measurement of contractile propagation velocity as an indicator of maturation
To evaluate the maturation index while culturing the formed fiber-like cardiac tissue, we established a method for measuring contraction propagation velocity by fluorescence live imaging. hiPSC-derived cardiomyocytes were modified permanently to express GCaMP, a calcium-responsive green fluorescent protein, to visualize the intracellular concentration of calcium ions. Since myocyte contraction is synchronized with the influx of intracellular calcium ions, the contraction propagation velocity can be evaluated as the propagation speed of the fluorescent signal. As a result, it was confirmed that the propagation velocity increased as the myocardium matured. Thus, we succeeded in evaluating the degree of maturity of the tissue while it was intact without fixation or other treatment.