高親和性コリントランスポーター（CHT1）は、コリン作動性神経末端においてNa+依存的なコリン取り込みを示し、アセチルコリン前駆体供給の役割を担う。CHT1はコリン作動性神経に特異的に発現している。CHT1を介するコリン輸送はアセチルコリン合成の律速段階であるため生理的に重要であり、実際にCHT1遺伝子欠損マウスはコリン取り込み能の欠如により生後間もなく致死となる。CHT1遺伝子変異を原因とする疾患の一つに、常染色体劣性遺伝性の先天性筋無力症候群がある。これは神経筋接合部に関わる分子の遺伝子変異を原因とする疾患であり、筋力低下や易疲労性、呼吸不全などの症状を引き起こし、重症の場合は致死となる。本研究では、先天性筋無力症候群に関連する変異について、19種類のCHT1変異体（D48G, G65E, S94R, P105S, R107H, Y111H, V112E, Y175C, P210L, S263F, I291T, A296T, P310L, V344L, R361Q, Y414N, F418V, R446G, S487P）を部位特異的変異導入により作製し、HEK293T細胞に発現させて各変異体の機能特性を調べた。まず、形質膜発現量を評価するため、親水性のビオチン化試薬を用いて形質膜タンパク質を精製し、ウエスタンブロットで解析した。その結果、R107H, Y175C, P310L, V344L, R446G以外の14種類の変異体では形質膜発現量が野生体に比べて25%以下であった。次に、CHT1変異体のコリン取り込み活性を評価したところ、全ての変異体について野生体の25%以下であった。本研究結果から、19種類のCMS関連CHT1変異体全てにおいてコリン取り込み活性の顕著な低下がみられ、その多くは形質膜発現量の低下に起因することが明らかとなった。
At cholinergic presynaptic terminals, the high-affinity choline transporter CHT1 mediates Na+-dependent choline uptake for acetylcholine synthesis. CHT1 is exclusively expressed in cholinergic neurons. CHT1-mediated choline uptake is pivotal for cholinergic function because choline uptake is the rate-limiting step in acetylcholine synthesis. In fact, genetic deletion of CHT1 in mice causes lethal respiratory paralysis. Recent studies revealed that mutations within the human CHT1 gene were associated with human diseases, such as congenital myasthenic syndrome. To examine the functional impact of the CHT1 mutations identified in this syndrome, we generated a series of 19 mutants by site-directed mutagenesis (mutants: D48G, G65E, S94R, P105S, R107H, Y111H, V112E, Y175C, P210L, S263F, I291T, A296T, P310L, V344L, R361Q, Y414N, F418V, R446G, and S487P) and examined functional properties of these CHT1 mutants expressed in HEK293T cells. Cell-surface biotinylation assays using a membrane-impermeable biotin reagent were performed to assess CHT1 cell-surface expression. Immunoblot analysis showed that most of the mutants (except for R107H, Y175C, P310L, V344L, and R446G) showed less than 25% of cell-surface expression level compared with the wild type. We next measured choline uptake activity of each mutant. All 19 mutants showed impaired choline uptake activity compared with the wild type (0-25%). These results indicate that most of the CHT1 mutants show impaired choline uptake activity with a concomitant change in cell-surface expression level.
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