令和5年度はセカンドメッセンジャーと変態の関係を調べるため、以下の実験を行った。
１．変態開始シグナルリソースの解明
これまでの研究で、ホヤ変態時に間充織細胞が表皮を越えて体外に出る（溢出する）ことを見出した。この溢出現象は脊椎動物の血球細胞や癌細胞の浸潤とよく似た現象であり、進化的に保存された細胞移動の仕組みを理解できる(Totsuka et al., 2023)。この溢出現象のトリガーとなるセカンドメッセンジャーのリソースを明らかにするためCa2+伝搬の時間逆解析を行ったところ、眼点直上の神経細胞(aATEN)付近の表皮からCa2+伝播が開始されることが示唆された。そこでaATENが変態のトリガーとなる重要なニューロンであることをオプトジェネティクスを用いた機能破壊実験および人工刺激実験により検証実験を遂行している。溢出誘導がcAMPを介している可能性を検討するため、cAMPセンサーを用いたライブイメージングを行った。
２．cAMPの変態開始における動態解明
変態の駆動にはcAMPが関与することが薬剤添加により示唆されていたが、cAMPが変態に直接かかわることを示した時空間的解析報告はない。そこで付着器の表皮細胞におけるCa2+濃度上昇とcAMP動態の関係を明らかにした。cAMPの動態を可視化するためにcAMP遺伝的センサーpinkFlamindoをホヤ幼生に導入し、変態前後の付着器における動態を調べたところ、驚くべきことに変態誘導のための機械刺激を与えた直後、cAMPは一時的に低下し、その後徐々に濃度が上昇することがわかった。ホヤ幼生は変態するのに適した場所で付着による機械刺激を感知し、変態するが自然界では流水や一時的な接触刺激では変態しないようなしくみが必要であるが今回の計測結果からcAMPの蓄積が変態のトリガーとなると考えられることから、付着器によるcAMP蓄積がある一定濃度に達した時に変態のスイッチが入る機構が働くことでこれらの機械刺激をわけて認識していると考えられる（投稿準備中）。
In FY2023, I conducted the following experiments to investigate the relationship between second messenger and metamorphosis.
1. Elucidation of metamorphosis initiation signal resources
Previous research has found that mesenchymal cells cross the epidermis and spill out of the body during ascidian metamorphosis. This extravasation phenomenon is similar to the invasion of blood cells and cancer cells in vertebrates, and allows us to understand the evolutionarily conserved mechanism of cell migration (Totsuka et al., 2023). In order to clarify the second messenger resource that triggers this extravasation phenomenon, I performed a time inverse analysis of Ca2+ propagation, which suggested that Ca2+ propagation starts from the epidermis near the nerve cells (aATEN) directly above the ocellus. Therefore, I am carrying out experiments to verify that aATEN is an important neuron that triggers metamorphosis through functional destruction experiments using optogenetics and artificial stimulation experiments. To examine the possibility that extravasation induction is mediated by cAMP, I performed live imaging using a cAMP sensor.
2. Elucidation of the dynamics of cAMP in the initiation of metamorphosis
Although drug addition has suggested that cAMP is involved in driving metamorphosis, there have been no spatiotemporal analysis reports showing that cAMP is directly involved in metamorphosis. Therefore, I clarified the relationship between the increase in Ca2+ concentration and cAMP dynamics in the epidermal cells of the appressorium. In order to visualize the dynamics of cAMP, I introduced the cAMP genetic sensor pinkFlamindo into ascidian larvae and investigated the dynamics in the palp before and after metamorphosis. It was found that, surprisingly, immediately after applying mechanical stimulation to induce metamorphosis, cAMP concentration decreased temporarily and then gradually increased. Ascidian larvae detect mechanical stimulation caused by attachment in a suitable place for metamorphosis and undergo metamorphosis in natural conditions, but in the natural world they must have a mechanism that prevents them from metamorphosing when exposed to running water or temporary contact stimulation. So it is thought that these mechanical stimuli are recognized separately by a mechanism that activates a switch for metamorphosis when cAMP accumulation in the palp reaches a certain concentration (in preparation).
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