タンパク質の特定の位置に薬物や蛍光分子などを人工的に結合する有機合成反応（化学修飾法）の開発は創薬において重要である。現在、リシンやシステインの化学修飾が汎用されている。しかし、タンパク質表面に同一アミノ酸が広く分布している、または、化学修飾試薬が交差反応性を示すため、人工分子が結合した数、位置が一定でないヘテロな集団が生成する。一方、本研究で標的とするN末端アミノ酸は、タンパク質に一つしか含まれないため、人工分子を導入する数、位置を制御するのに適していると期待される。
本研究では、銅(II)イオンのルイス酸性を利用したアルドール反応による、N末端アミノ酸の化学修飾法を開発に取り組んだ。種々のペプチドやタンパク質に対し、中性条件下、室温で、銅(II)イオンと2-ピリジンカルボキシアルデヒド(2-PC)誘導体を作用させると、2-PC誘導体が1分子または2分子結合した生成物が得られた。
N末端アミノ酸は、反応条件下、2-PCと反応すると、シッフ塩基の銅錯体を形成する。銅イオンのルイス酸性でN末端アミノ酸のα水素の酸性度が上昇し、中性条件下において脱プロトン化する。こうして生成した求核性の高い中間体がアルドール反応したと考えた。アルドール反応した後、近傍の主鎖アミドの分子内求核付加によりイミダゾリジノン環が形成する副反応が観察された。第一段階のアルドール反応は、種々の生理活性ペプチドやタンパク質のN末端アミノ酸上で進行した。しかし、続くアミドの分子内求核付加の反応性は基質によりさまざまで、結合する2-PCの数を制御することは困難であった。
本手法で蛍光標識した抗HER２抗体トラスツヅマブは、 HER2認識能を保持していることを蛍光顕微鏡観察、フローサイトメトリーにより確かめた。本手法は反応条件が温和でタンパク質の機能を損なうことなく修飾することができる。
Bioconjugation reactions for the protein modification with drugs and fluorophores becomes increasingly important in biopharmaceutical industry. To obtain a conjugate with uniform structure and properties, cysteine have been considered as the most reliable target for bioconjugation reactions because of both its low abundance in proteins and unique reactivity.
However, accessible free cysteine is rarely found in target proteins. As N-terminus exists in peptides and proteins as a unique reactive site, N-terminal modification can be considered as a complementary method to cysteine modification.
In this study, we have developed N-terminal selective modification via copper(II)-mediated aldol reaction with 2-pyridinecarboxaldehyde (2-PC) derivatives. The reaction can introduce bioorthogonal handles and drugs into peptides and proteins at neutral pH and ambient temperature. N-Terminal amino acid formed a ternary imine complex with 2-PC derivatives and copper(II) ion. Owing to Lewis acidity of copper(II) ion, deprotonation of alpha-proton occurred even at neutral pH. The resulting nucleophilic intermediate reacted with an aldehyde to afford the aldol product after the decomposition of the imine-copper(II) complex. However, because of high stability of the imine-copper(II) complex in aqueous reaction media, spontaneous nucleophilic addition of the adjacent amide nitrogen to imine was often observed to afford doubly modified product as a side product. Although the control of the number of modifications was challenging, the reaction realized complete N-terminal selectivity. Furthermore, the mild reaction conditions enabled the modification of trastuzumab, an anti-human epidermal growth factor receptor 2 antibody, without the loss of intrinsic antigen recognition activity.