ニコチン性ACh受容体 (nAChR) は5量体のイオンチャネル型受容体であり、多くの構成サブユニットが見出されている。中枢神経系ではα7およびα4β2型の発現が多く、学習・記憶や注意・集中などの高次脳機能に重要な役割を果たすことが知られている。その中でもα7 nAChRは、高いCa2+透過性をもち、神経伝達物質の放出を制御することでシナプス可塑性に関与することが報告されている。このため、α7 nAChRは神経変性疾患や精神疾患などの創薬ターゲットとして注目を集めている。我々は、様々な病態への関与が報告されているnAChRの機能を評価するためには、単にnAChRの遺伝子変異や発現変動を解析するだけでなく、内在的nAChR機能修飾因子に注目する必要があると考えた。これまで我々は、Ly6HがnAChRの細胞外領域に結合してチャネル活性を阻害することを新たに発見している。本研究では、新たにLy6H 欠損マウス（Ly6H KO）を作出し、Ly6Hの生理機能を解明することを目的とした。
CRISPR/Cas9システムによるLy6H KOマウス作出のために、Ly6Hに対する複数のguide RNAをCas9遺伝子を含む発現プラスミドへ組込みんだ。T7エンドヌクレアーゼ I アッセイにより評価した最適なKOコンストラクトを受精卵にマイクロインジェクションにより導入し、偽妊娠させたICR雌マウスに移植した。得られた産仔の尻尾よりgenome DNAを回収し、シーケンスを行って編集部位を確認した。このLy6H KOマウスを、C57BL/6マウスに6世代バッククロスして遺伝的背景の影響を少なくした上で、in vivoにおいてLy6Hがα7 nAChRの機能を抑制しているかを確認するため、ニコチン誘発性振戦の感受性について評価した。また、ニコチン投与により、内側手綱核や下オリーブ核などでの神経興奮が生じることが報告されていることから、Ly6H KOマウスにおける神経興奮の度合いを、c-fos染色を用いて野生型マウスと比較した。さらに、オープンフィールド試験によりLy6H KOマウスの行動学的特徴を抽出した。
Ly6KOマウスでは、開始メチオニンコドンの13塩基上流より、開始メチオニンコドンならびにalternate開始メチオニンコドンを含む、121 bpの欠失が確認された。Ly6H KOマウスのニコチン誘発振戦は、野生型マウスに比べて明らかな感受性の増大が確認された。また、Ly6H KOマウスでは、内側手綱核や孤束核において、c-fosタンパク質の発現が野生型マウスに比べ上昇していた。オープンフィールド試験では、不安関連行動の増加が観察された。
[Background] Nicotinic ACh receptors (nAChRs) are pentameric ion channel-type receptors for which many constitutive subunits have been found. In the central nervous system, the α7 and α4β2 types are frequently expressed and are known to play important roles in higher brain functions such as learning and memory, attention, and concentration. Among them, α7 nAChR has been reported to be involved in synaptic plasticity by regulating neurotransmitter release with high Ca2+ permeability. Therefore, α7 nAChR has attracted much attention as a drug discovery target for neurodegenerative diseases and psychiatric disorders. To evaluate the function of nAChRs, which have been reported to be involved in various pathological conditions, it is necessary to focus on intrinsic nAChR function modifiers, rather than merely analyzing nAChR gene mutations and expression fluctuations. Previously, we have newly discovered that Ly6H binds to the extracellular region of nAChR and inhibits its channel activity. In this study, we newly generated Ly6H-deficient mice (Ly6H KO) to elucidate the physiological function of Ly6H.
[Methods] To generate Ly6H KO mice by the CRISPR/Cas9 system, several guide RNAs against Ly6H were incorporated into an expression plasmid containing the Cas9 gene. The optimal KO construct, evaluated by T7 endonuclease I assay, was introduced into fertilized eggs by microinjection and transplanted into sham pregnant ICR female mice. Genome DNA was collected from the tail of the resulting litter and sequenced to confirm the editing site. The Ly6H KO mice were backcrossed to C57BL/6 mice for 6 generations to reduce the influence of genetic background. To confirm whether Ly6H suppresses α7 nAChR function in vivo, we evaluated their susceptibility to nicotine-induced tremor. Since nicotine administration has been reported to produce neuro-excitability in the medial habenula and inferior olivary nuclei, we compared the degree of neuro-excitability in Ly6H KO mice with wild-type mice using c-fos staining. In addition, we extracted behavioral characteristics of Ly6H KO mice by open field test.
[Results] In Ly6KO mice, a 121 bp deletion was identified 13 bases upstream of the initiating methionine codon, including the initiating methionine codon and the alternate initiating methionine codon. Ly6H KO mice showed an apparent increase in sensitivity to nicotine-induced tremors compared to wild-type mice. In addition, c-fos protein expression was elevated in the medial habenula and solitary bundle nuclei of Ly6H KO mice compared to wild-type mice. In an open-field test, an increase in anxiety-related behaviors was observed.