分泌型のシナプス形成分子Cbln1は小脳のシナプス形成・維持に必須であり、欠損マウスはシナプス消失を伴った小脳失調という典型的なシナプス病を示す。ごく最近、共同研究によってCBLN1遺伝子の変異がヒトで初めて見出され、患児が遺伝子欠損マウスと同じく歩行異常などの重篤な小脳失調を呈することが明らかとなった。申請者は、このCBLN1遺伝子疾患について、病態発症の分子メカニズムを解明し、さらにその治療法を実験動物のレベルで確立することを目的として、本研究を開始した。
まず培養細胞を用いた解析をおこなった。Cbln1を293T細胞に導入すると培養液に大量に分泌されるが、変異型では分泌が見られず、細胞内へ異常蓄積することが分かった。さらに細胞内輸送に伴う糖鎖修飾に異常が生じることを明らかにし、Cbln1の変異が、細胞内輸送の異常による分泌不全を引き起こすことを示した。
次にCBLN1変異モデルマウスを作出した。このマウスは期待通り、Cbln1欠損マウスやCBLN1変異患児と同じく重篤な小脳失調の症状を示した。このマウスを詳細に解析し、変異マウスではCbln1のシナプス局在がほぼ消失し、小脳においてシナプスが消失することが明らかとなった。これらの結果から、Cbln1の変異がCbln1の分泌を阻害することで、Cbln1の欠損と同じ機序で病態を引き起こすことが示唆された。
さらに本研究では、このCbln1変異モデルマウスの表現型の遺伝子療法の確立を行った。分泌されなくなったCbln1をウイルスによって補充する遺伝子療法を目指し、小脳の各種細胞に発現するアデノ随伴ウイルス(AAV)を作成した。これらのウイルスを用いることでCbln1を野生型と同じレベルで小脳に発現させることが可能となった。さらにCbln1欠損マウスを用いた予備実験では、小脳失調の症状とシナプス消失の表現型が回復することに成功している。今後は上記のCbln1変異モデルマウスにCbln1発現AAVを感染させ、遺伝子療法の効果を確認する予定である。
Cbln1 is a secreted-type synapse organizer, which is necessary for synapse formation and maintenance in cerebellum, whose deletion results in massive synapse loss and severe ataxia. Most recently, our collaborators found a novel CBLN1 mutation in human, and the patients have severe ataxia including gait dificit like Cbln1 deletion mouse. Our goal of this research project is to reveal how this novel CBLN1 human mutation induces cerebellar ataxia and establish a therapeutic method in the animal levels.
We first tested how this mutation induce Cbln1 disfunction in vitro. Although Cbln1 WT is secreted into culture media when it is transfected into 293T cells, mutant Cbln1 was not and accumulated inside of the cells. Additionally, the maturation of Cbln1 Glycosylation was also impaired. These results indicate that this novel mutation of Cbln1 induces abnormal intracellular trafficking and inhibit Cbln1 secretion.
Next, we made mouse line which has novel Cbln1 mutation using CRISPR/Cas9 knock-in system. Expectedly, this model mouse showed severe ataxia like Cbln1 deletion mouse and CBLN1 mutant patients. We further analyzed this model mouse, then we found that synaptic Cbln1 localization and synapse itself were severely reduced in cerebellum. These results suggest that inhibition of Cbln1-secretion by this mutation results in Cbln1 loss at synapses and the same effects of Cbln1-deletion.
Additionally, we tried to establish a therapeutic method for this Cbln1 mutant model mouse. We hypothesized that supplement of WT Cbln1 by gene therapy could rescue synapse loss and cerebellar ataxia in Cbln1 mutant model mouse. We mde several adeno-associated viruses expressing WT CBLN1 under L7, Syn and GFAP promoter, which express Cbln1 in cells of cerebellum, Purkinje cells, Molecular layer interneurons, and Bergman glia cells respectively. We confirmed that expression levels of CBLN1 by these AAVs are comparable for that in WT animals. Pilot experiments using Cbln1 deficient mouse revealed that CBLN1-expressing AAV rescues synapse loss and severe ataxia. Now we are planning to test the rescue effects of these CBLN1-expressing AAVs in CBLN1 mutant mouse.