小胞型神経伝達物質トランスポーターは神経終末において神経伝達物質をシナプス小胞に充填する重要な役割を担う。小胞型神経伝達物質トランスポーターがクラスリン依存性エンドサイトーシスを介し細胞内に移行することは、シナプス伝達の持続に不可欠である。クラスリン依存性エンドサイトーシスではクラスリンアダプタータンパク質AP2が標的膜タンパク質の細胞質側領域に存在する短いシグナル配列を認識して結合する。主要なシグナル配列は、チロシンモチーフ（YXXΦ, Φは大型の疎水性アミノ酸残基を表す）とジロイシンモチーフ（(D/E)XXXL(L/I)）である。申請者は、小胞型GABAトランスポーターVGATと小胞型グルタミン酸トランスポーターVGLUT1の細胞質側領域内に共通して存在する新規のエンドサイトーシス・シグナル配列を見出している。本研究では、このシグナル配列とAP2との結合様式を明らかにするため、東京大学定量生命科学研究所の小川治夫博士・豊島近博士との共同研究により、シグナル配列を含むペプチドとAP2の複合体についてX線結晶構造解析を目指した。AP2を構成する4つのサブユニットを大腸菌に共発現させ、グルタチオンセファロースとNi-NTA agaroseによるカラム精製、並びにゲルろ過クロマトグラフィーによって1 L培養液あたり0.5-1 mg のAP2複合体を精製した。VGATシグナル配列を含むペプチドとAP2の複合体を用いて結晶化を試み、結晶化溶液の沈殿剤濃度やpHについて条件検討を行った。最終的には、10 mg/mL AP-2, 7 mg/mL VGAT ペプチドと、40% PEG400, 0.2 M Lithium sulfate, 0.1 M Tris-HCl (pH 8.5) のリザーバーを用いたシッティングドロップ蒸気拡散法により、20℃で結晶を成長させて直径約20-40 µmの結晶を得た。
Vesicular neurotransmitter transporters are essential for loading of neurotransmitters into synaptic vesicles in the nerve terminals. Internalization of vesicular neurotransmitter transporters via the clathrin-mediated endocytosis is indispensable for sustaining synaptic transmission. The major endocytic clathrin adaptor AP2 recognizes and binds to a short endocytic signal sequence within the cytoplasmic region of the cargo in the clathrin-mediated endocytosis. The most common endocytic signals are the tyrosine (YxxΦ, where Φ represents a bulky hydrophobic residue) and dileucine ([DE]XXXL[LI]) motifs. We found novel endocytic signal sequences shared by the vesicular GABA transporter VGAT and vesicular glutamate transporter VGLUT1. In this study, X-ray crystal structure analysis of AP2 in complex with a peptide from VGAT is aimed at clarifying the binding mode of the peptide with AP2 (in collaboration with Drs. Haruo Ogawa and Chikashi Toyoshima, University of Tokyo). The four subunits of the AP2 core were co-expressed in Escherichia coli. The AP2 complex was bound to glutathione-sepharose and Ni-NTA agarose, and then purified by gel filtration chromatography with a yield of 0.5-1 mg of protein per liter of culture. Crystallization conditions were examined by varying the precipitant concentration and pH in preliminary experiments. Crystals with a diameter of 20-40 µm were grown at 20℃ from 10 mg/ml protein with 7 mg/ml VGAT peptide by vapor diffusion against 40% PEG400, 0.2 M Lithium sulfate, 0.1 M Tris-HCl (pH 8.5).