単一分子DNAシーケンサへの応用を目指し、単一塩基分解能・感度による表面増強ラマン分光の実証に取り組んだ。水中で自然形成される金ナノ粒子二量体の空隙に短鎖DNAを挟み込み、空隙での電場増強効果を活用したラマン計測を試みた。直径40nmの金ナノ粒子に対し、短鎖DNA吸着効率ならびに二量体形成効率を最大化するため、pH、塩濃度、温度の最適化を行った。測定対象としては、主に25塩基長のシトシン（C）の中央をアデニン（A）一塩基で置き換えたオリゴヌクレオチド（CACと表記）を使用した。プラズモン吸収スペクトル測定と電磁界シミュレーションにより、二量体間の空隙が約1nmであることを確認した。続いて、CACの挟み込みを最適化するためCAC濃度を検討した。ラマン計測を実施したところ、低濃度の場合はC由来のピークが支配的であるのに対し、高濃度へ向かうにともない、A由来のピークが逆転することが確認された。この結果に基づき、低濃度CACに対し、単一の二量体、すなわち単一CAC分子のラマン計測をブラウン運動下、10msの測定時間にて実施した。二量体ごとにC由来のみ、A由来のみ、両者由来のピークをもったスペクトルが得られ、特にA由来のピークのみが見られる場合があることから、一塩基分解能の達成が実証された。なお、CGCオリゴヌクレオチドに対しても同様の結果を得た。
実験と並行して、分子動力学計算によるDNA鎖の金表面への吸着機構・特性の解明に取り組んだ。A、G、Cのヌクレオチドに対し、金表面吸着の安定性を評価し、Cに対してA、Gの安定性が高いことが確認された。これは、ラマン計測においてCAC濃度が低い場合はC由来のピークが支配的（AもCも吸着しているが、C塩基数が多いため）、CAC濃度が高い場合はA由来のピークが支配的（Cが浮いた状態となり、Aのみ吸着しているため）という上記の結果と整合している。また立体配置より、塩基の吸着が二量体形成の直接的なメカニズムとはならないであろうと推測した。この結果は二量体形成において塩の添加が必要であることと整合している。
Aiming for application to single-molecule DNA sequencing, we have demonstrated surface-enhanced Raman spectroscopy of oligonucleotides with single-base resolution and sensitivity. An oligonucleotide was sandwiched in the gap of a gold nanoparticle dimer naturally formed in water, and Raman scattering spectroscopy was attempted utilizing the electric field enhancement in the gap. For gold nanoparticles (AuNPs) with a diameter of 40 nm, pH, salt concentration, and temperature were optimized in order to maximize the oligonucleotide adsorption efficiency and dimer formation efficiency. As a target DNA, an oligonucleotide (denoted as CAC) in which the center of cytosine (C) having a length of 25 bases was replaced with a single base of adenine (A) was mainly used. Plasmon absorption spectroscopy and electromagnetic field simulation revealed that the dimer gap was approximately 1 nm. Next, the CAC concentration was examined in order to optimize the sandwiching configuration of CAC. Through Raman scattering measurements, we found that the peak coming from cytosine was dominant in the case of low CAC concentration, while the peak from adenine became dominant with an increase of CAC concentration. At the optimized concentration of CAC, Raman spectra of single dimers involving a single CAC was measured under Brownian motion with a measurement time of 10 ms. Raman spectra differed from dimer to dimer with respect to the existence of peaks from cytosine and adenine. In some spectra, only the peak from adenine was observed, demonstrating the achievement of single-base resolution. Similar results were obtained for CGC oligonucleotides.
In parallel with the experiment, we conducted molecular dynamics simulation to elucidate the adsorption mechanism and characteristics of oligonucleotide on the gold surface. The adsorption affinity of oligonucleotides of adenine, guanine and cytosine on gold surface was evaluated, indicating that the nucleotides of adenine and guanine are more stable than that of cytosine. The result is consistent with that described above; in the case of low concentration of CAC, both A and C are adsorbed on the AuNP surface, while only A is adsorbed at higher CAC concentration. In addition, based on the adsorption orientation, it was speculated that adsorption of nucleotide would not be a direct mechanism of dimer formation. This result is consistent with the need for salts in dimer formation.