心臓領域特異的レポーター遺伝子をCRISPR/Cas9およびPiggybac systemを用いてゲノム編集したヒトiPS細胞を樹立した。全心臓前駆細胞の標識には、NKX2.5遺伝子の内因性エンハンサー・プロモーターを、一次心臓領域由来心臓前駆細胞の標識には、TBX5遺伝子の内因性エンハンサー・プロモーターを用いた。樹立したiPS細胞株は、発生過程でNKX2.5を発現した一次心臓領域由来心臓前駆細胞および二次心臓領域由来心臓前駆細胞はすべてRFPで、TBX5を発現した一次心臓領域由来心臓前駆細胞はGFPで蛍光標識される。実際、NKX2.5およびTBX5遺伝子の発現パターンに従って、心筋分化誘導開始6日目よりRFPおよびGFP蛍光の発現が認められ、誘導開始10日目に、GFPおよびRFPシグナルの有無に応じてFACSを用いて4分画に選別可能であった。さらに培養を継続し、心筋分化誘導を進めたのち、mRNA発現パターンを確認したところ、RFP陽性細胞群(NKX2.5陽性心臓前駆細胞)は心筋マーカーであるトロポニンTの発現量が高く、またGFP陽性群はGFP陰性群に比してTBX5遺伝子発現量が高値であった。これらの結果は、想定される各心臓領域特異的心臓前駆細胞の遺伝子発現パターンに合致し、このシステムの有用性を示唆する結果であった。一方で、このシステムで分けられる分画の中で、二次心臓領域由来心臓前駆細胞を示すNKX2.5陽性TBX5陰性分画は、その全細胞に対する割合が非常に少数であり、二次心臓領域由来心臓前駆細胞および心筋細胞を用いた実験系を組むことは困難が予想された。その問題を解決するために、NKX2.5に加えて、二次心臓領域由来心臓前駆細胞に特異的に発現するISL1を分子マーカーとして利用する方法を再検討し、ISL1の一過性の発現をもとに、永続的に細胞を蛍光標識するために、新たにCre-loxPシステムを使用する方針とした。
We generated the iPS cell line carrying the transgene which expresses fluorescent proteins under the control of promoters of heart field-specific cardiac transcription factors. We used NKX2.5 promoter for the first and second heart field promoter and TBX5 promoter for the first heart field-specific promoter. During the cardiac differentiation, the reporter iPS cells-derived first field cardiac progenitor cells express GFP and RFP, and second heart field cardiac progenitor cells express RFP. The reporter iPS cell-derived cardiac progenitor cells could express the fluorescent proteins at day 6 after starting cardiac differentiation and we could obtain each progenitor cells by FACS at day 10. RFP positive cardiac progenitor cells could express cardiac troponin T and GFP positive cardiac progenitor cells showed higher TBX5 expression compared to GFP negative cells. These results suggest the usefulness of the reporter system. However, we could not obtain the enough amount of second heart field progenitor cells due to the negative selection. To obtain the higher amount of second heart field cardiac progenitor cells, we decided to use ISL1 promoter as the second heart field-specific promoter. ISL1 temporally expresses in the second heart field progenitor cells so we are planning to use Cre-loxP system to label the ISL1 positive cells permanently.