本年度は, トキソプラズマ原虫(Toxoplasma gondii RH-strain)を用いて, マウス腹腔内での継体培養, またヒト線維芽細胞を用いた安定的な培養方法の確立に成功した。
培養して得られたトキソプラズマ原虫のtachyzoiteからgenomic DNAを抽出し, それを用いてToxoplasma gondii cox1遺伝子をターゲットにしたreal-time PCR法の開発を行った。検出限界は, 0.01pg/μLであり, 他の遺伝子をターゲットにした既報告と検出感度は同等であったが, 近年, 地域によってはこれまで標的遺伝子とされていた529bpを欠損しているトキソプラズマ原虫の存在が確認されている。そのため, より保存された遺伝子であるcox1遺伝子を標的にした本方法は, 地域・国を選ばない有用な遺伝子診断法であると考えられる。今後, 当教室に依頼される, 各種トキソプラズマ症疑いの臨床検体に応用し, 実際の感度・特異度を明らかにしていく予定である。
トキソプラズマの遺伝子型分類法については, 本年度はNanopore Oxford technologiesの MinIONを用いて, preliminaryな検討を行った。培養したToxoplasma gondii RH-strainのtachyzoiteからgenomic DNAを抽出して, Rapid sequencing kitを用いてトキソプラズマ原虫のシークエンスを行なった。しかしながら, 今回の検討では, 有意なデータを得ることができなかった。その理由についてであるが, 先行論文を参したところ, おそらく抽出したDNAの純度に問題があったものと考えられる。そのため, 次年度以降の検討では, DNA抽出にカラムを使用する, また抽出後に, DNAの純度を確認することが必須となる。また, 一般的に, トキソプラズマ症の臨床検体中のトキソプラズマDNA量は微量であるため, 遺伝子型分類の際の標的配列をPCR法, またはLAMP法で増幅することが必要となってくると考えられ, この点についても今後検討を行う。
In this fiscal year, we succeeded in establishing a stable culture method of Toxoplasma gondii RH strain grown in monolayer of HFF and intraperitoneal infection using BALB/c mice. We extracted genomic DNA from tachyzoiite of T. gondii obtained by cultivation and developed real-time PCR method targeting T. gondii cox1 gene. The detection limit was 0.01 pg/μL, and the detection sensitivity was the same as the reported cases targeting other genes. However, some toxoplasmosis cases deficient in 529 bp, previously regarded as the target gene, has been reported recently. Therefore, this method targeting the cox1 gene, is considered to be a useful genetic diagnostic method regardless of region or country. We plan to clarify the actual sensitivity and specificity by applying to clinical specimens of various toxoplasmosis.
For developing genotyping method of T. gondii, we used MinION (Nanopore Oxford technologies) for preliminary study. Toxoplasma gondii sequencing was performed using MinION Rapid sequencing kit (Nanopore Oxford technologies). However, We could not obtain significant data. We considered the failure was due to the purity and the extract method of genomic DNA. Therefore, it is essential to use a column for DNA extraction and confirm its purity. Since the amount of Toxoplasma DNA in clinical specimens is generally small, it is necessary to amplify the target sequence in genotyping by PCR method or LAMP method before sequencing.