単細胞緑藻類の中には窒素栄養欠乏(-N)下においてトリアシルグリセロール(TAG)を蓄積するオイル生産微細藻が存在する。また同条件では, オートファジーを誘導することが知られている。オートファジーは飢餓時に細胞質のオルガネラやタンパク質を液胞で低分子へとバルク分解する真核生物で広く保存された機構であり, 細胞は分解されたアミ ノ酸をタンパク質合成に再利用することで飢餓に応答している。しかし、それ以外の利用先に関する知見は乏しい。近年, 微細藻類が生産するTAGは, 二酸化炭素から新規に固定 された炭素分子以外に, 細胞内の炭素分子を炭素源として再利用している事が示唆されており, 再利用機構として知られるオートファジーがTAG蓄積にも関与しているのではないかと考えた。
本研究では, -N下でTAGを蓄積する緑藻類を対象に, オートファジーによる分解物とその代謝を明らかにするために2つの実験を行った。一つ目は, TAG蓄積におけるオートファジーの役割を明らかにするために, 栄養状態とは独立に薬剤添加によりオートファジーを誘導または阻害した時のTAG量の変化を調査した。その結果, TAG量が増加したこと から、オートファジーを制御するTarget of rapamycin (TOR)の下流にTAG蓄積機構があることが示唆された。しかし, オートファジーの分解を阻害剤で制御できなかったため, TAG蓄積へのオートファジーの関与については考察できなかった。二つ目は, オートファ ジーによって分解されたアミノ酸の代謝を明らかにするために, タンパク質を窒素安定同位体標識した細胞を用いて-N下でタンパク質からアミノ酸への同位体の移動を確認した。アミノ酸以外の代謝物質について調査したところ, ArgやLysの分解経路上の物質からも標識が検出された。このことから、窒素がない状態においていくつかのアミノ酸は, アンモニアとして窒素源を排出するかアミノ基転移をすることで, 炭素骨格へ分解されると推測された。
Some of unicellular green algae accumulate a large amount of triacylglycerol (TAG) under nitrogen deficient (-N) conditions. Under the same conditions, autophagy is also induced in Chlamydomonas reinahrdtii Autophagy is widely conserved catabolic process in euka^otes, whereby cytosolic organelles and protein complexes are degraded to monomeric units in vacuole during starvatioa These degradation products of protein are recycled to protein sjnaithesis adapting to starvation. However, degradation products and its metabolic utilization are almost unknown. Recently, some reports have su^ested that TAG is synthesized by not only photosynthetically fixed compounds but also intracellular compounds. Therefore, I speculated that autophagy relates to TAG accumulation as recycling pathway of carbon source under -N conditions in green alga.
In this study, I focus on the degradation products by autophagy and its metabolic utilization in oil-rich alga, and planned two experiments. Firstly, to clear the role of autophagy in TAG accumulation, I examined TAG accumulation during pharmacological autophagy induction or inhibition, which independent to nutritional conditions. As the results, TAG was accumulated by autophagy induction, therfore TAG accumulation is probably regulated downstream of Target of rapamycin (TOR), a regulator of autophagy. However, it was not demonstrated the involvement of autophagy in TAG accumulation, because autophagy inhibitore did not work for an autophagic degradation in C. reinhardtii. Secondly, to find metabolic utilizations of degradation products by autophagy, all amino acids in proteins were labeled by stable nitrogen isotope (15N) and free amino acids were unlabeled using modified a method of long-lived protein degradation assay. Labeling ratio of free amino acids increased under -N conditions, and intermediate metabolites on Arg and Lys degradation pathway were also labeled by 15N. Therefore, some of amino acids are supposed to be degraded to carbon skeleton and ammonia under -N conditions.
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