骨芽細胞は骨基質を分泌し, 石灰化骨を産生する細胞である。マイクロCT装置を用いてマウス全身骨格の骨密度を定量的に可視化したところ, 耳小骨の骨密度が最も高かった。また, 骨に含まれるタンパク質の9割以上を占めるI型コラーゲンの発現部位可視化できるCol1a1-GFPマウスを観察した結果, 骨密度が高い耳小骨は周囲の骨に比べてI型コラーゲンの発現が極端に低いことが分かった。以上のことから, 耳小骨の骨密度が高い要因は骨基質タンパク質の違いにあると考え, 骨密度の高い耳小骨と平均的な骨密度の長管骨骨幹部のそれぞれから骨基質タンパク質を抽出し, 質量分析を行った。長管骨からは石灰化骨の主要細胞外基質であると考えられているI型コラーゲンのみが検出されたのに対し, 耳小骨からはI型に加えてII型コラーゲンも検出された。従来, II型コラーゲンは軟骨基質と考えられており, 石灰化骨の構成成分として検出されたことは意外な結果であった。さらにin situハイブリダイゼーションによりII型コラーゲン遺伝子Col2a1の発現を調べたところ, 長管骨では成長板の軟骨細胞でCol2a1が発現していたのに対し, 耳小骨では軟骨細胞に加え, 石灰化骨の細胞外基質を産生している骨芽細胞でもCol2a1が発現していることが確認できた。また, 間葉系培養細胞を用いた骨芽細胞分化誘導実験では, I型コラーゲンやII型コラーゲン, マトリックスプロテアーゼなど, 骨芽細胞を特徴づける遺伝子群の発現が細胞外基質の違いによって変化することが明らかとなった。この結果は, 細胞外基質の違いが骨密度の高い骨を産生する骨芽細胞への分化を誘導することを示唆している。以上の結果より, 我々はこのCol2a1を発現している骨芽細胞を骨密度の高い骨を作る新たな骨芽細胞として同定し, 「超石灰化骨芽細胞(hypermineralizing osteoblasts)」と名付けた。
Osteoblasts are cells that produce bone matrix and form mineralized bones. We revealed that auditory ossicles were the most highly mineralized bones in the mouse skeleton by quantitative bone mineral density (BMD) analysis using micro CT. Moreover, analysis of Col1a1-GFP transgenic mice expressing green fluorescent protein under control of the type I collagen (Col1a1) promoter indicated that the auditory ossicles express extremely low levels of type I collagen relative to surrounding bones. These results suggest that the high BMD of auditory ossicles is caused by specialized collagen matrix. We therefore analyzed collagens from auditory ossicles, to gain insight into collagen subtypes produced by Col1a1low osteoblasts in high BMD bones. By mass spectrometry, the femoral diaphysis exhibited type I collagen only, a skeletal bone exhibiting average bone mineral density, while bony auditory ossicles produced both type I and II collagens, as major components of the collagen matrix. This was surprising because type II collagen is thought to be predominantly expressed in cartilage. In situ hybridization also demonstrated that osteoblasts in auditory ossicles express Col2a1. In vitro experiment using a mesenchymal stem cell line indicated that exogenously-added collagen matrix subtypes altered the expression pattern of type I and type II collagens, and osteocalcin. This suggests that characteristic collagen matrix of auditory ossicles can stimulate generation of Col2a1-expressing cells. From these data, we propose that these Col2a1-expressing cells, be called ‘hypermineralizing osteoblasts'.