Phosphatase and tensin homolog(PTEN)遺伝子はヒトおよびマウスの腫瘍において変異が多数報告されている腫瘍抑制因子である。PTENタンパクはPI3K-AKT経路のシグナル伝達に拮抗するフォスファターゼとしての機能が多く報告されているが, 近年, 核内における機能も明らかになってきた。本研究ではゲノム編集技術(TALEN)を用いてPTEN機能欠損メダカを作出し, PTEN欠損を補う薬剤スクリーニングへの応用を試みた。データベース上の配列から, メダカにもゼブラフィッシュと同様, 2つのpten遺伝子ptenaおよびptenbの存在が推測されたため, ptenaおよびptenbを標的としたTALENコンストラクトを個別に作製し, 16系統のptena変異と2系統のptenb変異を樹立した。ホモ接合型単一変異個体は, 生存可能で妊性もあることが判明したが, pten二重欠失胚は, 受精後3日になっても脈管が形成されず, 7日胚で眼球が小さく尾部の発達が不十分となる表現型を示し, 孵化前に死亡した。ウェスタンブロット解析を行ったところ, pten 二重欠失胚ではリン酸化AKTの量比(pAKT/AKT)は野生型の4倍となっており, PI3K経路のシグナル伝達が亢進していることが示された。また pten二重欠失胚にPI3キナーゼの阻害剤LY294002を投与すると, pAKT/AKT比は約2分の1に減少し, 脈管も不完全ではあるが部分的に形成された。PI3K経路下流の阻害剤(ラパマイシンおよびN-α-tosyl-L-phenylalanyl chloromethyl ketone)を投与した場合も, 二重欠失胚における脈管形成を部分的に回復させることができた。本研究で作製したモデルシステムでは, 発生初期の段階でpten二重欠失胚を野生型胚と容易に区別することができるため, PTEN機能欠損を緩和する薬剤のスクリーニングに適している。
Phosphatase and tensin homolog (PTEN) is a lipid and protein phosphatase that antagonizes signaling by the phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)–AKT signaling pathway. The PTEN gene is a major tumor suppressor, with mutations of this gene occurring frequently in tumors of humans and mice. This study developed mutant medaka deficient in PTEN with the use of transcription activator–like effector nuclease (TALEN) technology. Medaka possesses two pten genes, ptena and ptenb, similar to zebrafish. 16 ptena mutant lines and two ptenb mutant lines were established. Homozygous single pten mutants were found to be viable and fertile. In contrast, pten double-knockout (dko) embryos manifested severe abnormalities in vasculogenesis, eye size, and tail development at 72 hours post fertilization(hpf) and died before hatching. Immunoblot analysis revealed that the ratio of phosphorylated to total forms of AKT (pAKT/AKT) in pten dko embryos was four times that in wild-type embryos, indicative of up-regulation of signaling by the PI3K-AKT pathway. Treatment of pten dko embryos with the PI3K inhibitor LY294002 reduced the pAKT/AKT ratio by about one-half and partially rescued the defect in vasculogenesis. Additional inhibitors of the PI3K-AKT pathway, including rapamycin and N-α-tosyl-L-phenylalanyl chloromethyl ketone, also partially restored vasculogenesis in the dko embryos. This model system allows pten dko embryos to be readily distinguished from wild-type embryos at an early stage of development and is suitable for the screening of drugs able to compensate for PTEN deficiency.
|
